Memeli Hücrelerinde Nicel Görüntüleme Kullanılarak Plazma Zarı ve Hücre İçi Nikotinik Asetilkolin Reseptörlerinin Lokalizasyonu

Memeli plazma zarlarına nikotinik asetilkolin reseptör trafikini anlamak, şaperon aracılı düzenlemenin araştırılması ve hedef seçici tedavilerin değerlendirilmesi için çok önemlidir. pH hassasiyetli probların canlı hücre konfokal mikroskobu ile birleşmesinin temel avantajlarından biri, alt birim konumunun yüksek mekansal çözünürlüğüdür. Başlamak için, reaktifleri 37 derece Celsius'a kadar önceden ısıtın.

nAChR alt birimi DNazı tamamen eritin ve transfeksiyon reaktifini oda sıcaklığına getirin. Tüm reaktifleri biyogüvenlik dolabına yerleştirmeden önce %70 etanol ile temizleyin. Alfa-7 nAChR'leri mikro santrifüj tüpünde ifade etmek için, alfa-7 ve NACHO plazmid DNazını indirgenç serum ortamına seyreltirin.

DNA eklendikten sonra pipetle nazikçe karıştırın. Alternatif olarak, alfa-4 beta-2 reseptörlerini ifade etmek için, her alt birim DNA'dan 4 mikrogramı toplamda 250 mikrolitre indirgenmiş serum ortamına seyreltilin ve nazikçe karıştırın. Belirli reseptör izoformlarının ekspresyonunu optimize etmek için alt birim oranlarını ayarlayın.

Alfa-4 beta-2 reseptörleri için ek plazmid ile her plazmid DNA'sından eşit miktarda eklenir. Sonra, yeni bir mikro santrifüj tüpünde, 8 mikrolitre transfeksiyon reaktifini 250 mikrolitre indirgenç serum ortamına damla seyreldin. Oda sıcaklığında 5 dakikalık kuluçkadan sonra, seyreltilmiş DNazı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifiyle damla olarak bir tüp içine birleştirin.

Nazikçe pipetle karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın. Kompleksler oluşurken, kültür tabaklarındaki ortamı 1 mililitre serumsuz EMEM ile değiştirin. Her kaba damla 500 mikrolitre DNA transfeksiyon reaktif kompleksi ekleyin.

Plakayı sallayarak nazikçe karıştırın, özellikle cam alt yüzey üzerinde eşit dağılım sağlanır. Plakayı 37 derece Celsius'ta 24 saat kuluçka yapın ve 4-6 saat sonra ortamı değiştirin. Eski ortamı emiş yoluyla çıkarın.

Kabı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca iki mililitre PBS ile üç kez durulayın. Sonra kaba 2 mililitre pH 7.4 görüntüleme tamponu ekleyin. Görüntüleme kabını konfokal mikroskobun slayt tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu önceden ısıtılmış çevresel odaya yerleştirin.

Peristalttik pompa borusunu görüntüleme çanaklı tutucuya bağlayın ve çevresel odayı kapatın. Şimdi, görüntüleme yazılımını başlatın ve ilgi çeken floroforlar için lazerler seçin. Tabağı taramak için hücreleri 10-60 x boyutlu bir objektif kullanarak tarayın.

İsterseniz büyütmeyi artırın ve netleme derinliğini gerekirse ayarlayın. Tercih edilen çözünürlüğü seçin ve istenen hedefi kullanarak tek bir görüntü yakalayın. Tampon değişikliğinden sonra aynı hücreleri yeniden konumlandırmak için çanak haritasına konumu kaydedin.

Tüm görüntüler için aynı yakalama ayarlarıyla antenanın birkaç alanı için görüntüleme tekrarlanın. Sadece çıkış hattını peristaltik pompaya bağlı tutarak, pH 7.4 tamponunu çanaktan yavaşça atık konteynerine çekin. Sonra giriş hattını pH 5.5 söndürme tamponuna aktarın.

Peristalttik pompayı açarak dakikada 1,5 mililitre akış hızında pH 5.5 tampon ekleyin, böylece hücrelerin bağlı kalmasını sağlar. 20 dakika sonra, pompayı kapatın ve hücreleri buffer'daki hücreleri denge sağlamak için ek 20 dakika kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra, kaydedilen bölgelerin tekrar görüntülenmesini yapın.

Görüntü niceliklendirmesine başlamak için ImageJ'yi açın ve analiz edilecek görüntüyü yükleyin. Görüntü, her yakalanan kanalın aynı çerçevede gösterildiği bir yığın olarak görünecektir. Faz kanalına geçin.

Eğer görüntü aşırı parlak görünüyorsa, Süreç'i seçin ve Kontrastı Artır'ı seçin, ardından OK tuşuna tıklayın. Büyüteç aracını kullanarak bir hücreye yakınlaştırın. Faz kanalında hücrenin hatlarını izlemek için serbest el seçim aracı kullanın. Sonra ilgilenilen florofora karşılık gelen floresan kanala geçin.

İstediğiniz ölçümleri Analiz et'i seçip Ölçümleri Düzenle'ye tıklayarak ayarlayın. Alan, Ortalama gri değer ve Entegre yoğunluğun kontrol edildiğinden emin olun. Seçilen bölgeyi ölçmek için Analiz et'i seçin ve ardından Ölç'e tıklayın.

Seçilen hücrenin yakınındaki boş alanları izleyerek üç arka plan ölçümü alın. İstenilen tüm hücreler için ölçümler yapıldıktan sonra, ölçüm verilerini analiz için Excel'e kopyalayıp yapıştırın. Sonra üç arka plan ölçümünden ortalama arka plan ortalamasını hesaplayın.

Her hücre için düzeltilmiş toplam hücre floresansı veya CTCF değerini sağlanan formülü kullanarak hesaplayın. Aynı iş akışını kullanarak, tampon değişiminden sonra elde edilen görüntüleri analiz edin. Tüm sonuçları istatistiksel işlem için veri analiz yazılımına dışa aktarın.

Transfekte edilmemiş N2a hücrelerinde zayıf alfa-BTX AF647 boyama gözlemlenirken, alfa-7 DNA ile transfekte edilen hücrelerde sağlam nokta etiketleme tespit edildi. Nicel belirleme, alfa-7 transfekte edilen N2a hücrelerinde alfa-7 nAChR'lerin plazma zarı ekspresyonunun, transfekte edilmemiş kontrollere göre anlamlı şekilde daha yüksek olduğunu doğruladı. pH 7.4'te, plazma zarında toplam alfa-7 pHuji floresansı görünürdü.

transfekte edilmiş N2a hücrelerinde. pH 5.5'te alfa-7 pHuji floresansı azaldı ve iç reseptör lokalizasyonu ortaya çıktı. Dış alfa-7 pHuji reseptör floresansı, reseptör ekspresyonunun çoğunluğunu oluşturdu.

Nicel hesaplama, alfa-7 pHuji reseptörlerinin %82,6'sının plazma zarında, %17,4'ünün ise dahili olduğunu gösterdi. Floresans pH 7.4'e dönerken geri getirildi ve pHuji sinyalinin tersine çevrilebilirliği doğrulandı. pH 7.4'te, alfa-4 SEP ve beta-2 pHuji ifade eden N2a hücreleri her iki alt birim için sağlam membran floresansı göstermiştir.

pH 5.5'te floresans söndürülmüştür, bu da bazı alfa-4 SEP ve beta-2 pHuji alt birimlerinin iç lokalizasyonunu gösterir. Nicel hesaplama, alfa-4 SEP'in %76,5'inin plazma zarında, %23,4'ünün ise iç bölgede olduğunu gösterdi. Üçlü transfekte edilen hücrelerde, alfa-4 SEP %82,8 membran lokalizasyonu ve %17,2 iç ifadesi göstermiştir.

Aynı hücrelerde, beta-2 pHuji alt birimlerinin %63,4'ü membranda, %36,6'sı ise hücre içi olarak konumlanmıştır. Sunulan protokolü kullanarak, nikotin reseptör ekspresyonu ve ticareti üzerindeki yeni şaperon etkilerini karakterize ettik ve yeni hedef seçici tedavileri değerlendirdik. Protokolümüzün bir avantajı, homomerik ve heteromerik nikotin reseptörleri için uyum sağlayabilmektir; bu da göreceli hücresel konumun nicelendirilmesini sağlar.

Yaklaşımımız, çapperon aracılı taşım analizi ve ilaç keşif çalışmalarına yardımcı olarak, hızlı ve sağlam nikotin reseptör plazma zarı ekspresyonunu sağlar.