Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek İçin Fare Prostat Organoid-Tabanlı Modelin Oluşturulması

Bu araştırma, bakteri patojenlerinin prostat epitelini nasıl enfekte ettiğini ve hangi konak patojen etkileşimlerinin enfeksiyon sonucunu belirlediğini anlamaya odaklanmaktadır. Mevcut in vitro modeller prostat epitel çeşitliliğini kötü yakalamıştır. Bu model, dokuda bulunan hücre tiplerinin farklarını yansıtan fizyolojik olarak ilgili bir sistem sağlar.

Başlangıç olarak, 24 delikli bir plakada hücre dışı matriks damlaları üzerinde kültürlenen üç boyutlu mare prostat organoidleri alın. İstenilen sayıda kuyudan ortamı aspire edin ve her kuyuya 500 mikrolitre taze kültür ortamı ekleyin. P 1000 pipeti kullanarak, her kuyunun ekstrahücre matriks düşüşünü mekanik olarak bozun.

Bu süspansiyonu, her tüp başına en fazla iki kuyuyu toplamak zorunda olan 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Hacmi 10 mililitre çıkarmak için taze kültür ortamı ekleyin. Tüpü nazikçe üç-dört kez ters çevirerek 450 G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca karıştırın ve santrifüj yapın.

Üst natantı aspire edin. Pelleti iki mililitre enzim çözeltisine yeniden askıya alın, 37 derece Celsius'a kadar ısıtın ve süspansiyonu 37 derece Celsius'ta su banyosunda 15 dakika kuluçka edin. P 1000 pipeti kullanılarak hücre süspansiyonunu her beş dakikada bir kuluçka sırasında karıştırın.

İnkubasyondan sonra, son hacmi 10 mililitre ulaşmak için taze kültür ortamı ekleyin. Tüpü nazikçe üç-dört kez ters çevirerek karıştırın. Santrifüj 450 G'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta yapıldı.

Süpernatantı pelleti rahatsız etmeden aspire edin. Pellet, 10 mikromolar kaya inhibitörü ile takviye edilmiş 300 mikrolitre kültür ortamında yeniden askıya alın. Nöbbaer sayma odası kullanılarak süspansiyondaki hücreleri sayın.

Süspansiyonu, 10 mikromolar kaya inhibitörü ile takviye edilmiş kültür ortamında mililitrede 62.500 hücre konsantrasyonuna kadar seyreltirin. Sonra 48 kuyuluğa sahip bir plaka için her kuyu başına 200 mikrolitre süspansiyon ve odalı mikro slaytlar için kuyu başına 300 mikrolitre tohum ekin. Plakaları hücre kültüründe 37 derece Celsius ve %5 karbondioksit sıcaklıkta inkübe edin.

Bir gün sonra, çoğu tek hücrenin iki boyutlu kültür yüzeyine bağlanıp bağlanmadığını kontrol edin. Kültür ortamını her iki-üç günde bir değiştirin ve yedi gün içinde birleşene kadar kültüre devam edin. Luminal hücreleri zenginleştirmek için farklılaşmayı teşvik etmek için, tohumlama sırasında hücre süspansiyonuna beş alfa dihidrotestosteron veya DHT'den oluşan 10 nanomolar ekleyin.

Uropatotik Escherichia coli suşunu (UPEC) mililitrede 100 mikrogram ampisilin takviyesi olan bir LB agar plakasına çizerek koyun. Plakayı 37 derece Celsius'ta 16 ila 24 saat boyunca kuluçkaya geçirin. Steril bir halka ile üç mililitre LB suyu ve mililitrede 100 mikrogram ampisilin ile takviye edilmiş tek bir bakteri koloni ile aşılanmıştır.

Kültürü 37 derece Celsius'ta statik olarak 12 ila 16 saat boyunca kuluçka yapın. Gece boyunca bakteriyel kültürü girdabla değiştir. Kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometre olarak ölçün.

Sonra, üç mililitre çorbada 0,05 başlangıç optik yoğunluğuna ulaşmak için gereken kültür hacmi hesaplanın. Hesaplanan bakteri kültür hacmini taze ampisilin takviyeli LB çorbasına ekleyin. 37 derece Celsius'ta 24 saat statik olarak kuluçka yapın.

İnkubasyondan sonra bakteri kültürünü girdablandırın. Optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün. Bir optik yoğunluk elde etmek için gereken kültür hacmini hesaplayın.

Gerekli hacmi 12.000 G'de oda sıcaklığında iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve atın. Bakteriyel pelleti DHT olmadan bir mililitre primus ve serbest organoid kültür ortamında yeniden askıya alın.

Sonra, süspansiyonu fare prostat organoid kültür ortamıyla seyreltirerek enfeksiyon çokluğu 100 elde edilir. Hazırlanmış organoid bazlı modelden kültür ortamı aspire edilir. 48 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna bakteri içeren 200 mikrolitre kültür ortamı ekleyin.

37 derece Celsius'ta bir hücre kültürü kuluçkasında %5 karbondioksit ile bir saat kuluçka yapın. Kuyulardan bakteri içeren ortamı aspire edin ve kuyuyu, hücre dışı bakterileri çıkarmak için taze kültür ortamıyla üç kez yıkayın. Sonra, mililitrede 50 mikrogram gentamisin içeren kültür ortamı ekleyin ve 30 dakika kuluçka yapın.

Ortamı aspire edin. Kalan enfeksiyon süresi için mililitrede 10 mikrogram gentamisin takviyesi ile taze kültür ortamı ekleyin. Floresan boyamadan sonra enfekte hücreleri görüntülemek için konfokal mikroskop kullanın ve enfekte hücreleri akış sitometresi kullanarak niceliklerini ölçebilirsiniz.

Dihidrotestosteron olmayan kontrol durumunda çoğu hücre sitokeratin beş pozitif bazal hücreydi ve sadece birkaçı düşük CD 24 8 luminal ekspresyonu gösterdi. Bir nanomolar DHT takviyesi karışık bazal luminal popülasyonlar üretti, ancak CD 24 A düşük kaldı. DHT'nin 10 nanomolara yükselmesi, luminal hücrelere farklılaşmayı teşvik ederken, yedi gün kültür sonrası bazı bazal hücreleri korurken.

Bu, sitokeratin beş pozitif bazal hücrede azalma ve CD 24A pozitif luminal hücrelerde artış ile DHT konsantrasyonu arttığını gösteren nicelendirme çalışmalarıyla koreluştu. Enfeksiyondan sıfır saat sonra, UPEC epitel hücrelerine yüksek sayılarda yapıştı. Bir saat süren gentamisin tedavisinden sonra, UPEC pozitif hücrelerin sayısı keskin şekilde azaldı.

24 saat içinde enfekte hücre sayısı bir saattekilere benzerdi. 24 saat içinde yapılan konfokal görüntüleme, hücre içi bakterilerin topluluk benzeri kümeler oluşturarak çoğalmaya devam ettiğini gösterdi. Bu protokol, araştırmacıların epitel hücresel çeşitliliğini koruyan bir modelde bakteriyel enfeksiyon dinamiklerini ve bu patojen etkileşimlerini incelemelerine olanak tanır.

Gelecekteki çalışmalar, bu modeli enfeksiyonlar, kanser biyolojisi dahil olmak üzere çeşitli prostat hastalıklarını incelemek ve potansiyel terapötik bileşikleri test etmek için kullanabilir.