19 Aralık 2025
Bu protokol, kriyokonsertif at menisinden canlı somatik hücreleri (SC'ler) izole etmek için basit bir mikroaspirasyon tekniği sunar. Geleneksel yaklaşımların aksine, bu teknik uzun in vitro kültürlerden kaçınır ve sperm kontaminasyonunu engeller; böylece somatik hücre klonlamasında hemen kullanılmasını sağlar.
Kriyokonsertif at menisinden elde edilen somatik hücrelerin, yüksek genetik değere sahip bireyleri kurtarmak için faydalı olabileceğini göstermeyi hedefliyoruz. Mevcut zorlukumuz, sağlam diploid DNA'ya sahip somatik hücreleri nükleer donör olarak seçebilmek. Başlamak için, sıvı azot tankından at spermi pipetlerini çıkarın.
Onları 10 saniye havaya maruz bırakın ve 37 derece Celsius'ta su banyosunda 30 saniye eritin. Eritilmiş meniden 250 mikrolitre bir numune alın. Bir mililitre takviyeli DMEM-F12 ortamıyla seyreltin.
Sperm karışımını 37 derece Celsius'ta 30 dakika kuluçka yapın. İnkübe edilmiş seyreltmeden 25 mikrolitre pipetle bir tüpe alın ve 975 mikrolitre DPBS ile seyreltin, buna mililitrede 0,1 miligram polivinil alkol veya polivinil pirolidon eklenerek incelendirin. Süspansiyonu nazikçe karıştırın.
Sulandırılmış meninin karışımını tüm hücre toplama süreci boyunca 37 derece Celsius sıcaklığında tutun. Somatik hücre toplama için hazırlanmak için seyreltilmiş at menisi içeren Petri kabı kapağını mikroskop aşamasına yerleştirin. Somatik hücre toplama için uygun çapta bir mikropipet seçin ve mekanik aspirasyon sistemine bağlayın.
Mikropipeti dikkatlice mikro damlaya yerleştirin ve bulag kapağının tabanıyla hizalayın. Pipet kültür ortamını aspire ettikten sonra, somatik hücrelerin bireysel olarak ele geçirilmesine başlanır. Mikro damlanın alt kısmına odaklanın, burada çeşitli hücre morfolojileri görülebilir.
Mikropipet ucunu her somatik hücrenin yanına yerleştirin ve negatif basınç altında aspirasyon yapın. Boyut ne olursa olsun yuvarlak ve uzun hücreleri toplayın. 10 hücre toplandıktan sonra, onları kapağın üst yüzeyinde bulunan 10 mikrolitrelik mikro damlaya bırakın.
Toplanan tüm somatik hücreleri bu mikro damla içinde tüm toplama süreci boyunca tutun. İstenilen somatik hücre sayısı toplandıktan sonra, sperm, kalıntı ve mikrobiyal kirleticileri çıkarmak için mikro damlalarla basit bir yıkama işlemi uygulanır. İkinci bir kapağı kullanarak, somatik hücrelerin ardışık üç aşamalı yıkamasını gerçekleştirin.
Mikropipet kullanarak somatik hücreleri ilk damlaya aktarın ve üç ila beş dakika boyunca yerleşmelerine izin verin. Aynı prosedürle hücreleri ilk damladan ikinci damlaya aktarın. Transferi bir kez daha tekrarlayın ve somatik hücreleri üçüncü damlaya yerleştirin.
Son olarak, izole somatik hücreler, somatik hücre nükleer transferi için hazırlanmış bir mikro damlaya yatırılır. Mikro aspirasyon tekniği, üç aygırda saatte 317,7 ila 424,7 hücre yakalama oranlarıyla kriyokonserif edilmiş at menisinden somatik hücreleri başarıyla geri kazandı. En yüksek verimli 3 aygır gösteriyor.
Boyut ve morfolojiye göre beş farklı somatik hücre tipi tanımlandı. Kriyokonserif at meninde morfoloji ve yaşamlılık açısından farklılık gösteren, nükleer donör olarak faydalı olabilecek bir somatik hücre popülasyonunu tespit ettik. Hücreler morfolojilerine göre seçilebilir ve prosedür birincil kültür oluşturulmasını gerektirmez.
At menisini bulklaştırdıktan sonra bu hücrelerin canlılığını artırmaya odaklanacağız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Bu protokol, kriyoprezerve edilmiş at menisinden canlı somatik hücreleri izole etmek için bir mikroaspirasyon tekniği sunar. Bu yöntem, uzun in vitro kültürler ve sperm kontaminasyonunu önleyerek, somatik hücre klonlamada hemen kullanılmasını sağlar.
Efficient recovery of viable somatic cells from cryopreserved equine semen addresses a critical bottleneck in genetic resource utilization for advanced reproductive technologies. This microaspiration technique enables immediate access to diploid donor cells for somatic cell nuclear transfer (SCNT), bypassing the need for prolonged culture and mitigating sperm contamination. The approach expands the potential for genetic rescue and portfolio diversification in animal biotechnology pipelines.
This microaspiration method integrates at the interface of genetic resource recovery and SCNT-based cloning, bridging cryopreservation banking with immediate nuclear donor preparation.