Memeli hücrelerinde peroksizoma özgü problarla peroksizom boyama

Bu nedenle araştırmamız, lipid metabolizması ve hücresel oksidatif denge için temel organeller olan peroksisomları anlamaya odaklanıyor. Amaçlarımız bu yapıların ve işlevlerinin nasıl düzenlendiğini ve bu süreçlerin hastalıkta nasıl değiştiğini ortaya çıkarmaktır. Bunu başarmak için, bize ve daha geniş bilim topluluğuna çeşitli hayvan hücrelerinde peroksizomları görselleştirmemizi sağlayan floresan problar geliştiriyoruz.

Burada, hem canlı hem sabit hücrelerde çalışan boyama protokolleri geliştiriyoruz ve sağlık ve patolojide paroksetin biyolojisini incelemek için güçlü araçlar sağlıyoruz. Başlıca deneysel zorluklardan biri, hayvan hücrelerinde peroksizomların invaziv olmayan etiketlenmesini sağlamaktır. Antikor boyama bu durumu aşmaya yardımcı olsa da, paroksismal proteinler için ticari olarak mevcut antikor eksikliği vardır.

Bir diğer zorluk ise peroksizomları gerçek zamanlı olarak invaziv olmayan şekilde görselleştirmektir; bu da uyarlanabilir protokoller gerektirir. Ve son olarak, geleneksel boyama işlevsel bir gösterim sağlamaz. Peroksidaz bazlı boyama, paroksismal fonksiyona bağlı olarak değişebilir; bu hem bir zorluk hem de fırsattır, çünkü hücre içindeki paroksismal fonksiyonel durumları ayırt etmemizi sağlar.

Bir gün önce tohumlanmış memeli hücreleriyle başlayın, örtü kapakları şu anda %30 ila 70 arasında birleşiyor. Peroksizom probu taze ortamla işığa duyarlı, mikro-santrifüjlü bir tüpte seyreltirerek dört mikromolar nihai konsantrasyon elde edilir. İstediğiniz kuyu seçin ve dışını marker kalemiyle etiketleyin.

Seçilen kuyiden 0,5 mililitre medya aspire edin ve kuyu duvarı boyunca damla damla hazırlanan prob ortamı ile değiştirin. Dağıttıktan sonra, hücreleri 37 derece Celsius sıcaklığında 10-15 dakika kuluçka edin. Bundan sonra, hücreleri alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.

İnkubasyon sonrası, lekelenmiş ortamı dikkatlice çıkarın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Sonra, plakayı kimyasal bir başlığın altına yerleştirin, hücrelere PBS içinde %4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın. Fiksasyondan sonra paraformaldehiti belirlenmiş bir atık konteynerine çıkarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.

Sonra, hücreleri geçirimlileştirmek için PBS'ye %0,5 Triton X ekleyin ve 2,5 dakika kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra Triton X'i çıkarın ve hücreleri PBS ile iki kez 10 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri engellemek için, onları dört derece Celsius'ta gece boyunca PBS içinde %5 sığır serum albümini ile inkübe edin.

İmmünofluoresan boyama işlemini standart protokole uygun olarak gerçekleştirin. Son olarak, hem sabit hem de canlı hücrelerin görüntülerini almak için mikroskopi yapın. Peroxi_SPY problarla canlı hücre boyama, ATP-bağlayıcı kaset alt ailesi D-bağımlı peroksisomlara ithalata yol açtı ve metabolik aktif hücrelerde yüksek bir peroksizom-sitoplazma floresan oranı oluştu.

GFP-SKL eksprese eden yabani tip HEK-293T hücrelerinde, Peroxi_SPY555 boyama peroksisomlarla belirgin kolokalizasyon gösterirken, peroksisom olmayan PEX19 knockout hücrelerinde boyama yoktu. İnsan fibroblastlarında, Peroxi_SPY boyama paroksismal işaretleyici GFP-SKL ile kolokalize olmuş ve peroksizom hedeflemesini doğrulamıştır. Peroksisom yoğunluk niceliklendirmesi, farklı hücre tipleri arasında önemli farklılıklar göstermiştir.

COS-7 hücrelerinde 250 nanomolar Peroxi_SPY kullanılarak 20 dakika boyunca optimize edilmiş boyama koşulları, orijinal bir mikromolar protokole kıyasla peroksizom-sitoplazma floresan oranını önemli ölçüde artırdı. HEK-293T hücrelerinin Peroxi_SPY ile 24 saat boyunca uzun süreli kuluçkası, peroksizom-sitoplazma floresans yoğunluk oranının 15 dakikaya kıyasla iyileşmesine yol açtı; peroksizom boyama azalmasına rağmen. Fiksasyon protokolü, HuH-7 ve HEK-293T hücrelerinde korunmuş Peroxi_SPY etiketleme ve Anti-PEX14 immünboyama ile başarılı antikor kostainingini mümkün kılmıştır.

Nicel belirleme, fiksasyon ve permeabilizasyon prosedürlerinin canlı hücre boyamalarına kıyasla peroksizom-floresans yoğunluğunu etkilediğini göstermiştir. Hem canlı hem de sabit hayvan hücrelerinde peroksizomları görselleştirmek için kullanılabilecek Peroxi_SPY boyayı geliştirdik. Flüoresan probumuz, peroksizom dinamiklerini, heterojenliği ve işlev bozukluğunu daha önce sınırlı olan şekillerde incelemek için basit ve hızlı bir yöntem sunabilir.

Bu protokol, paroksismal bozukluklara sahip hasta kaynaklı hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde görüntüleme tabanlı peroksisom araştırmalarını mümkün kılacaktır.