Dijital Damla PCR (ddPCR) kullanılarak toprakta Mikrobiyal Biyokütlenin Belirlenmesi

Çalışmamız, çeşitli toprak tiplerinde mikrobiyal biyokütleyi doğru şekilde nicelendirmek için damlacık dijital PCR ve tam genom dizileme kullanmaktadır. Geleneksel yöntemler büyük toprak örnekleri ve zararlı kimyasallar gerektirir. ddPCR, mutlak gen ve biyokütle karbon nicelendirmesi için minimal toprak kullanır.

Başlamak için, toprak DNA çıkarma kitinin reaktiflerini birleştirerek DNA'yı 20 derece oda sıcaklığında toprak mikroplarından izole etmek için birleştirin. İki mililitrelik boncuk vurma borusunu kısa bir süre döndürün ve boncukların alt kısımda yerleşip oturmadığından emin olun. 100 miligram toprak ekleyin, ardından 800 mikrolitre Solution CD1 ekleyin ve kısa bir süreliğine girdabı karıştırın.

Örneği iyice lizlemek için saniyede altı metre hızda 40 saniye boyunca bir boncuk değirmeni homojenizörü kullanın ve mekanik hücre lizisi elde etmek için oda sıcaklığında 15.000 g ağırlığında 15.000 g santrifüjlenerek mekanik hücre lizisi sağlanır. Hâlâ toprak parçacıkları içeren süpernatantı, temiz iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 200 mikrolitre Solution CD2 ekleyin.

Beş saniye girdab, 15.000 g'de bir dakika santrifüj yapın. Pelleti rahatsız etmeden temiz iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 700 mikrolitre kadar süpernatan aktarın. Süpernatana 600 mikrolitre Solution CD3 ekleyin ve beş saniye boyunca girdap ekleyin.

650 mikrolitre karışımı bir döner kolona yükleyin ve 15.000 g seviyesinde bir dakika boyunca santrifüj yapın. Akışı atın ve kalan lizat için işlemi tekrarlayın. Sonra, dönme kolonunu temiz iki mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirin.

Spin kolonuna 500 mikrolitre Solution EA ekleyin ve oda sıcaklığında 15.000 g boyunca bir dakika boyunca santrifüj yapın. Akış kutusunu atın ve spin kolonunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin. Daha önce gösterildiği gibi spin kolonuna 500 mikrolitre Solution C5 ekleyin ve santrifüj yapın.

Akışı attıktan sonra, spin kolonunu yeni iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 16.000 g değerinde santrifüj yapın. Dönme kolonunu yeni bir 1,5 mililitrelik elusyon tüpüne yerleştirin. Spin kolonunun filtre membranının ortasına 50 ila 100 mikrolitre C6 Çözeltisi ekleyin.

15.000 g ile bir dakika boyunca santrifüj yapın. Spin sütunu atıldıktan sonra eluenti içeren tüpü dört derece Celsius'ta saklayın. Üreticinin talimatlarını takip ederek florometre ve çift zincirli DNA geniş menzilli test kiti kullanarak ekstraksiyon edilen DNA'yı nicelikle ölçün.

Bakteri ve mantar analizi için, spesifik 16S rRNA ve 18S rRNA primerleri seçilir. Çözüldükten sonra tüm reaktifleri buz üzerinde vortex yapın. Dijital Damla Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ddPCR) kurun.

Damla jeneratör kartuşunu (DG8) kartuş tutucusuna yerleştirin. Kartuştaki her bir örnek yuvasına toplam 20 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin. Sonra iyi etiketlenmiş kartuşa 70 mikrolitre Damla Üretim Yağı Evagreen ekleyin.

Kartuşu damla jeneratörüne yerleştirin ve bir conta ile örtün. Üretilen damlalardan 40 mikrolitre, PCR amplifikasyonu için 96 kuyuklu yarı etekli plakanın her bir kuyusuna aktarın. Plakayı, beş saniye boyunca 180 derece Celsius sıcaklığına önceden ayarlanmış bir plaka sızdırmazlayıcı ile mühürleyin.

Termal döngü profilini yapılandırın ve ısıtılan kapağı 105 derece Celsius olarak ayarlayın. PCR tamamlandıktan sonra, 96 kuyruklu plakayı plaka okuyucuya aktarın. QuantaSoft sürüm 2.1'i kullanarak, genlik eşiğini negatif ve pozitif damlacıkları ayıracak şekilde ayarlayın.

Her kuyudan, DNA'nın nanogramı başına gen kopyası sayısı, çıkarılmış DNA'nın nanogramı başına toplam gen kopyaları, ekstraksiyonda işlenen toprak gramı kuru ağırlığı başına gen kopyaları ve toprak kuru ağırlığı başına hücre sayısı gibi parametreleri değerlendirin. Ayrıca, bir kuyu başına gram kuru ağırlık başına bakteri ve mantarlara karşılık gelen Mikrobiyal Biyokütle Karbonu (MBC) hesaplanın. Beş noktadan toprak DNA'sının üçlü analizi, numune başına 32 nanogramdan gram kuru toprak başına 4.590 nanograma kadar değişen ortalama mikrobiyal DNA konsantrasyonları ortaya çıkardı.

Toprak B, en az 16S rRNA gen kopyasını içeriyordu; ortalama 8,8 kat 10 ile yedi gücünde, 18S rRNA gen kopyaları ise ortalama 4,6 kat 10 ile gram kuru toprak başına altı genin gücünde. Buna karşılık, Toprak E, ortalama 4,4 çarp 10 ile dokuz ve 2,5 kat 10 ile dokuz kuvveti ile en yüksek 16S ve 18S rRNA gen kopyalarına sahip oldu; bu da diğer tüm örneklerden önemli ölçüde farklılık gösterdi. Mantar kopyaları A, B, C ve D topraklarında benzer kalsa da, Toprak D'deki bakteri sayıları hem B hem de E'den önemli ölçüde farklıydı. En yüksek mikrobiyal içerik Toprak E'de gözlemlendi, en düşük mikrobiyal içerik ise Toprak B'den alınan örneklerde A, D ve E'den anlamlı şekilde farklılık gösterdi. Bu protokol, araştırmacıların toprak topluluk dinamiklerini ve yapısını mikrobiyal biyokütle ve mantar-bakteri oranı üzerinden ölçmesine olanak tanır.

Damlalı dijital PCR için kullanılan aynı şablon DNA, mikrobiyal topluluk ve fonksiyonel analizi mümkün kılmak için DNA dizileme için de kullanılabilir.