Otomatik hücre segmentasyonu kullanılarak birincil insan hava yolu epitelyal kültürlerinde floresans tabanlı kalsiyum görüntüleme

Tek hücreli transkriptomikler, kistik fibrozlu hava yolu epitelinde heterojenliği ortaya koyar. Hücre tipine özgü işlevlerin ve değişikliklerin hastalık patogenezini nasıl etkilediğini anlamayı amaçladık. Mevcut zorluk, tek hücreli proteomik ve fonksiyonları doğru şekilde ölçmektir.

Bu da teknik geliştirme gerektiriyor. Başlangıç olarak, Eagle's Minimum Essential Medium Culture Medium Medium içeren T-25 şişelerinde Calu-3 hücrelerini %20 FBS ve %1 penisilin streptomisin takviyesi ile tutun. Hücreler yaklaşık %70 birleşimine ulaştığında, hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın.

Yıkamadan sonra, hücrelere doğrudan bir mililitre TrypLE ekleyin ve termosunu 37 derece Celsius ve %5 karbondioksit sıcaklığında ayarlanmış bir kuluçka makinesine 10-15 dakika boyunca yerleştirin. Sonra TripLE'yi dört mililitre taze tam kültür ortamı ekleyerek nötralize edin ve hücre süspansiyonunu iyice karıştırın. Hücreleri, yaklaşık %90 ila %100 birleşimde 96 kuyruklu bir plakaya kaplayın; bu, her kuyu başına yaklaşık 40.000 hücreye karşılık gelir.

Hücrelerin gece boyunca 96 kuyu plakasına yapışmasına izin verin. Her gün medyayı değiştirin ve hücreleri birleştirme sonrası iki ila beş gün boyunca kültüre geçirmeye devam edin ki farklılaşmaya izin versin. Deney gününde, Calu-3 hücrelerini yıkayın ve uygun boyalarla kuluçkaya geçirin.

Sonra, boya sitoplazmik boşlukta kalsiyum tamponu içinde kalsiyum tamponu içinde seyreltilmiş 2,5 millimolar probenecid kuyusuna 100 mikrolitre ekleyin ve plakayı ışıktan korumak için alüminyum folyoya sararak görüntülemeye kadar kullanın. Birincil hava yolu hücreleri için. Transwell'den bazolateral ortamı çıkarın ve apikal tarafı 300 mikrolitre kalsiyum tampon ekleyerek yıkayın.

Sonra bazolateral tarafı 750 mikrolitre kalsiyum tampon ekleyerek yıkayın. Pipetle tamponu çıkarın ve yıkamayı her iki tarafta bir kez daha tekrarlayın. Sonra, hücreleri apikal tarafta 200 mikrolitre boya çözeltisi ve bazolateral tarafta 600 mikrolitre ile bir saat boyunca 37 derece Celsius ve %5 karbondioksit sıcaklıkta kuluçka yapın.

Kuluçka sırasında, kalsiyum tamponu içinde seyreltirilmiş hapsigargin üç kat ara stok olarak hazırlanır. Kuyrukta son iki mikroazı dişini elde etmek için konsantrasyonu altı mikro molara ayarlayın. İnkubasyondan sonra, boya çözeltisi hem apikal hem de bazolateral bölmelerden pipetle ile çıkarılır.

Hücreleri apikal tarafa 300 mikrolitre kalsiyum tamponu ve bazolateral tarafa 750 mikrolitre kalsiyum tamponu ile iki kez yıkayın. Sonra pipetle tamponu çıkar. Sonra, apikal bölmeye kalsiyum tamponunda 100 mikrolitre 2,5 milimolar probenecid ekleyin ve aynı çözelti 500 mikrolitre bazolateral bölmeye ekleyin.

Transwell insertini plakanın içinde tutarak, tüm plakayı ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın ve sarılı plakayı görüntüleme için bir kenara koyun. Fiji başvurusunu açın. Video dosyasını yüklemek için Dosya ve Aç seçeneğini seçin.

Ortaya çıkan açılır pencerede tüm varsayılan ayarları koruyun ve seçimi onaylayın. İsterseniz, görüntü gösterisini ayarlayarak Görüntü'yü, Düzen'i seçip Parlaklık Kontrastı'na tıklayın. Hücrelerin optimal görünümünü sağlamak için bireysel floresan kanallarının parlaklık ve kontrastını değiştirin.

Hücre izlemeyi kolaylaştırmak için, Image, Color seçerek ve Merge Channels'a tıklayarak kanalları birleştirin. Açılır pencerede, her kanala uygun dosyaları atayın ve seçimi onaylayın. Takip için Analiz et, Araçlar seç ve ROI Manager'ı aç.

Ortaya çıkan açılır pencerede, hem Hepsini Göster hem de Etiketler seçeneklerini etkinleştirin. Serbest el seçimi aracıyla, hücre sınırları ve nükleer boyaya göre bireysel hücreleri dikkatlice takip edin. Sonra T tuşuna basarak her izlenen hücreyi ROI listesine ekleyin.

Hücrelerin görüş alanının dört köşesinde ve videonun ortasında izlendiğinden emin olun. Tüm hücreler doğru şekilde izlendikten sonra, ROI Manager penceresinde Daha Fazla'ya tıklayın ve Çoklu Ölçü seçeneğini seçin. Ortaya çıkan açılır pencerede, ölçüme başlamak için OK tuşuna basın.

Video dosyasını Fiji'de açın. Görüntü ayarlama araçlarıyla nükleer ve yeşil floresan kanallarını görüntüleme için optimize edin. Kanallar optimize edildikten sonra, Görüntü ve Tekrarla'yı seçerek tek bir kare çoğaltın.

Ortaya çıkan açılır pencerede, Duplicate stack seçeneğini kaldırın ve çoğaltılan görüntüyü PNG görüntü dosyası olarak kaydedin. Diğer kanal için Görüntü seçip Tekrarlamayı seçerek kare çoğaltmasını tekrarlayın. Açılır pencerede OK tuşuna basın ve görüntü bir PNG dosyası olarak kaydedilir.

Kaydedilen iki görüntüyü birleştirmek için Image, Color'u seçin ve Merge Channels seçeneğine tıklayın. Sonra her PNG dosyasını uygun kanala atayın ve birleştirmeyi onaylayın. Birleştirilen görüntüyü hücre sonrası grafik kullanıcı arayüzüne yükleyerek bir hücre maskesi oluşturun.

Görüntüyü nükleer boyayı kanal bir olarak kullanarak segmente yapın, sitoplazmik boya ise kanal iki olarak sito3 modeli seçilir. Şimdi, oluşturulan maske görselini PNG dosyası olarak kaydedin. Fiji'de aç ve TIFF dosyasına dönüştür.

Son olarak, hem maske dosyasını hem de orijinal video dosyasını kalsiyum paketinde yazılım arayüzüne sürükleyip bırakarak açın. İndirilebilir bir grafik ve analiz edilen tüm hücreler için normalleştirilmiş ve ham yoğunluk değerlerini içeren indirilebilir bir CSV dosyası oluşturmak için Veriyi Analiz Et'e tıklayın. Fluo-4 ve Cal-520 kullanılarak ölçüldüğünde, hapsigargin uyarısından sonra bireysel Calu-3 hücrelerinde başlangıç seviyesine normalize edilen floresans yoğunluğu, Cal-520 ile ölçüldüğünde Calu-3 hücrelerinde Fluo-4'e kıyasla anlamlı şekilde daha yüksekti. Benzer şekilde, bireysel birincil hava yolu ve bronşiyal hücrelerde, hapsigargin stimlimasyonundan sonra zamanla normalleşmiş floresans artışı gösterdi.

Ayrıca, Cal-520 yüklü hücrelerde maksimum kalsiyuma bağlı floresan aktivasyonu anlamlı şekilde daha yüksekti. Makine öğrenimi tabanlı analiz, tek bir görüş alanından 1.441 bireysel hücrede kalsiyuma bağlı floresan değişikliklerini tespit etmiş ve niceliklemiştir. Yazılım tarafından üretilen normalize floresan izleri, hapsigargin uyarısından sonra tanımlanan 1.441 hücrenin tamamında kalsiyum yanıtları gösterdi. Çalışmalarımız, farklı hücre tiplerinin çevrelerine verdiği yanıtları anlamaya yardımcı olacak ve bu da hedefli tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

Bulgularımız, belirli hücre tiplerine odaklanma potansiyeline sahip, çevresel uyaranlara belirli canlı hücre yanıtları atamağı. Gelecekte, hastalık ve sağlıklı hücrelerde hücre tipine özgü sinyalin nasıl değiştirildiğini inceleyerek sorumlu tipleri belirlemeyi hedefliyoruz.