Farelerde Servikal Lenfatik Damarların Kasılması ve Lenf Akışının In vivo İki Foton Görüntülemesi için Tekrarlanabilir Kurulum

Farelerde servikal lenfatik damar kasılması ve kırmızı kan hücrelerinin lenfatik olarak alınmasının yeni bir görüntüleme ihtiyacını sunuyoruz. Servikal lenfatik damarların işlevlerini incelemek, özellikle lenf akışının kasılma ve iz dolaşımlarının uzun vadeli gözlemlenmesi gerektiğinde zordur. Başlamak için, cihazın tabanı olarak 270 milimetre uzunluğunda ve 43 milimetre genişliğinde çelik bir optik ray yerleştirin.

Çelik optik rayın üstüne iki direk tutucu takın, aralarında 175 milimetre mesafe sağlansın. Direk tutuculara 12 milimetre çapında iki montaj direği yerleştirin ve her birini M6 vidalı ile sabitleyin. Sonra her iki montaj direğine bir direk tasması takın.

Montaj direklerinden birine dik açılı, sabit direkli bir kelepçe sabitleyin ve M6 vidasını kullanarak sıkıca sabitleyin. Dik açı direk kelepçesinin yan deliğine 12 milimetrelik bir montaj direği yerleştirin. Yan montaj direğine 3D baskılı bir tutucu takın ve iki çift M3 vida ile sabitleyin.

UV ile kürlenebilen yapıştırıcı kullanarak, koruyucu 3D baskılı bir kasanın altına 12 milimetre çapında bir örtü camı yapıştırın. Sonra koruyucu kılıfı M4 vida/somun çiftiyle 3D baskılı tutucuya sabitleyin. Çelik optik ray tabanına iki masa klipsi ve M6 vida, somun ve aldayan setleri kullanarak dikey hareket için hassas bir pantograf masası takın.

Sonra 155 milimetre uzunluğunda ve 110 milimetre genişliğinde 3D baskılı bir kutuyu masanın üzerine yerleştirin. Bu kılıf, tuzlu çözeltinin biriktirilmesi için bir rezervuar görevi görür. Kabloların ısıtma elementi bir'e bağlanma noktasını ince bir silikon tabakasıyla kaplayın.

Sıcaklık sensörü birini matın üzerine sabitleyin ve silikonla kapatın. Isıtma elemanının ve sıcaklık sensörlerinin tellerini çok telli bir kabloya lehimleyin. Bağlantı noktasını silikonla doldurun ve shrink wrap ile kapatın.

Isıtma elementi iki ve sıcaklık sensörü ikiyi köpük ruloya yerleştirin. Güç kablosu ve güç düğmesinin konnektörlerini kontrol ünitesi kutusunun duvarlarına sabitleyin. Kutu içine 24 voltluk bir doğru-akım güç kaynağı, bir doğruakım aşağı akım dönüştürücü ve iki MOSFET modülü takın.

Devre monte edilip gerekli bileşenleri lehimledikten sonra, Arduino Uno ve klavye ekranını kapak gövdesine sabitleyin. Sıcaklık seçimi alanını bulun. Sıcaklığı ayarlayın ve çalıştırın.

Fare anestezi edildikten sonra, ameliyat sırasında göz küreklerinin kurumasını önlemek için her iki göz kapağına da göz merhemi sür. Arka bacak çekilme refleksi ve kuyruk çekme refleksi sona erdiğinde, fareyi sırt üstü ısıtıcı elemanın üzerine koyun, böylece karın bölgesine erişim sağlanır. Kontrol ünitesini, giriş voltajı 175 ila 240 volt alternatif akımla bir elektrik prizine takın.

Tıbbi bant kullanarak, hayvanın vücudunu masa yüzeyine paralel bir konuma sabitleyin ve başı, sapın bir tarafının ruloya yaslanacak şekilde sagittal eksenine açılı şekilde yerleştirin. Üst kesici dişlerin etrafına bir bağ sarılıp cihazın arkasına takın ve hayvanın vücut sıcaklığını korumak için tıbbi bant kullanın. Sonra, boyun bölgesindeki tüyleri tıraş edin.

Sonra kalan gevşek tüyleri çıkarın ve steril alanı korumak için hayvanı kapatın. Birincil dezenfeksiyon için, boyun derisini alkol sürüntüsüyle dezenfekte edin. Daha sonra antiseptik tedavi için %0,5 klorheksidin veya %2 iyot solüsonu uygulayın ve dezenfeksiyon işlemi iki kez daha tekrarlanın.

Anestezik derinliği parmak sıkıştırma refleksiyle doğrulandıktan sonra, boyun derisi boyunca alt çeneden köprücük kemiğine kadar yaklaşık iki santimetre uzunluğunda uzunlamasına bir kesi yapılarak dermatotomi yapılacaktır. Sonra mikrocerrahi kavisli makasla fasyotomi yapın. Kavisli cımbız kullanarak, tükürük bezlerini ve yüzeysel boyun kaslarını nazikçe kenara iterek sternokleidomastoid kası ortaya çıkarın.

Görünür kan damarlarının zarar görmediğinden emin olun ve doku hasarını önlemek için cerrahi alanı sürekli olarak tuzlu su ile nemlendirin. Sternokleidomastoid kas miyotomisi yapmak için mikrocerrahi makas kullanın; böylece trakea ile karotis arter arasındaki bölgeye erişim sağlanır. Kasları ve fasyayı yaymaya devam edin, hem miyotomi hem de fasyotomi yapın.

Sonra, derin servikal lenf düğümünü afferent ve efferent lenfatik damarlarla birlikte beş ila yedi milimetre derinlikte konumlandırın. Sabit hayvanı tutan cihazı hareketli mikroskop masasına yerleştirin. Ve görüntüleme sırasında stabilite sağlamak için cihazı bir M6 vidalı ile sıkıca sabitleyin.

Kateteri, önceden tuzlu bir çözeltiyle doldurulmuş şekilde, montaj direğine tıbbi bant ile takın. Hayvanın başının yan tarafındaki ısıtma elemanının altına bir santimetre çapında bir rulo yerleştirerek mikroskop masasına göre 45 derece eğim sağlanır. Daha sonra sabit kateteri, cerrahi olarak açılmış boyun bölgesine yerleştirin, böylece hayvanın köprücük kemiği bölgesine yakın konuma getirilir ve salin akışını açarak açık boyun boşluğunu tuzlu çözeltiyle doldurursunuz.

Koruyucu kılıfı, tuzlu su ile doldurulmuş boyun bölgesinin üzerine indirerek lenfatik damar gözlem alanının merkezinde yer alsın. Sonra koruyucu kılıfı trakeyaya baskı uygulamadan yerleştirin. Son olarak, suya batırılmayan iki fotonlu lensi, lensin çalışma mesafesine göre koruyucu kılıfın içine doğru derinliğe indirin ve servikal lenfatik damarın iki fotonlu görselleştirmesi gerçekleştirilir.

İşlemden sonra, derin servikal lenf düğümlerinin başarılı şekilde tanımlanması dokuda Evans Blue birikmesiyle doğrulandı. Servikal lenfatik damar kasılmasının iki fotonlu izlemesi, fotobiyomodülasyondan önce ve sonra gerçekleştirilmiştir. Fotobiyomodülasyon, benzer yoğunlukta 2 ve 18 aylık farelerde servikal lenfatik damar kasılmasını önemli ölçüde artırdı.

Kantif analiz, servikal lenfatik damar kasılmalarının 24 aylık farelerde 2 ve 18 aylık farelere kıyasla anlamlı şekilde daha düşük olduğunu gösterdi. Ancak, değerler 2 ve 18 aylık fareler arasında anlamlı bir şekilde farklı değildi. Fotobiyomodülasyon, 2 ve 18 aylık farelerde servikal lenfatik damar kasılmasını anlamlı şekilde artırdı, ancak 24 aylık farelerde hiçbir etkisi olmadı.

Sağ lateral ventriküle enjekte edilen kırmızı kan hücreleri, enjeksiyondan dört saat sonra servikal lenfatik damarlarda gözlemlendi ve beş saat boyunca lümenden geçmeye devam ederek beyinden periferiye yönlü akışı doğruladı. Protokolümüz, servikal lenfatik damar fonksiyonunun in vivo izlenmesini sağlarken, kasılmayı beş saate kadar gözlem süresince korur. Yöntemimiz iyi tekrarlanabilirlik sunar ve çeşitli iki foton mikroskoplar ile objektif lenslerle uyumludur; aynı zamanda 500 mikrometreye kadar derinlikte yüksek kaliteli görüntü sağlar.

Bu teknik, beyin drenaj sisteminin fizyolojisini ve servikal lenfatik damarların işlevlerini incelemek için evrensel bir araç haline gelebilir.