Kemik Yenilenmesi ve İskelet Performansını Değerlendirmek İçin Multimodal Yaklaşım

Araştırmamız, rejenerasyon sürecinde farklı biyomalzemelerin kemik mimarisine nasıl etki ettiğini değerlendirmektedir. Kemik yenilenmesi, doku hiyerarşik olarak organize edildiği için çok ölçekli bir değerlendirme gerektirir. Bu protokol, örneğin farklı ölçeklerde analiz edilmesini sağlar.

Başlangıç olarak, implante edilen biyomateryali içeren reçineyle gömülü tibia'yı örnek tutucuya sabitleyin ve bunu alet koluna takın. Örneği istenen bölümleme yönüne göre yönlendirin. Kemiği yaklaşık 0,7 milimetrelik dilimlere ayırmak için düşük hızlı bir elmas testere diski alın.

Sıvı rezervuarını, sıvı seviyesi bıçağın alt kenarını tamamen kaplayana kadar doldurun. Numunenin sabit ve disk yüzeyiyle yatay hizalı olduğundan emin olun. Hedef kesim bölgesi bıçakla hizalanana kadar pozisyon düğmeleriyle örnek konumunu ayarlayın.

Örneği daha yüksek hız ayarıyla kesmeye başlayın ve bir girinti oluşana kadar düşük basınç uygulayın. Sonra hızı düşürerek kesitleme işlemi sorunsuz tamamlayıp titreşimi en aza indirin. Kesim tamamlandıktan hemen sonra testereyi durdurun.

Sonra montaj için stereo mikroskopla kesilen örneği inceleyin. Montaj için, iç katı paslanmaz çelik silindir ve parlatma sırasında mekanik destek sağlayan dış içi boş silindirden oluşan ev yapımı bir montaj kullanın. Sonra, iç silindiri bir sıcak plakaya koyup yaklaşık 120 ila 140 derece Celsius sıcaklığa ısıtın.

Uygun bir balmumu seçin ve ısıtılan silindirin yüzeyine az miktarda balmumu uygulayın ve tamamen erimesini sağlayın. Daha sonra örneği ilgilendiğiniz yüzeyi aşağıya bakacak şekilde mum kaplı alana yerleştirin ve erimiş mumla tam temas sağlamak için numuneyi nazikçe bastırın. Sonra alüminyum silindiri sıcak plakadan çıkarın ve balmumunun oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.

Kaba ve ara parlatma için, örnek kalınlığını yaklaşık 0,15 milimetreye indirmek için 1, 200, 2, 2, 500 ve 4, 100 kum boyutlarına sahip zımpara kağıdı seçin. 1,200 grit zımpara ile başlayın, ardından hafif basınç uygulayarak 2,500 grit kullanın. Parlatma sırasında numune kalınlığını yansıtma mikroskopisi ile periyodik olarak izleyin.

Hedef kalınlığa ulaşıldığında, örneğin her iki tarafını 4,100 grit zımpara kağıdı ile parlatın. Her parlatma aşamasında numuneyi sürekli olarak damıtılmış suyla temizleyin. Son cilalama için, numunenin yüzey pürüzlülüğüne göre altı veya üç mikrometrelik parçacık boyutunda bir elmas macunu seçin.

Az miktarda elmas macunu bir keçe parlatma bezine uygulayın, bu bez bir parlatma diskine monte edilmiş ve örneği parlatın. Numuneyi silindirden ayırmak için, mumu sıcak plakada ısıtın. Üniteyi sıcak plakadan çıkardıktan sonra numuneyi silindirden çıkarın.

Sonra numunenin her iki tarafını minimal basınçla nazikçe parlatın ve cilalanmış yüzeyi filtre kağıdıyla kurutun. Mikroskopi analizinden önce, numuneyi bir cam sürgü ile kapak sürüşmesi arasına monte etmek için batdırma yağı kullanılarak monte edilir. Kolajen lifinin yönelimini, polarize ışık mikroskopisiyle inceleyin; 5x ile 10x arasında düşük büyütmeyle başlayın.

Son olarak, kemik-biyomateryal arayüzünü daha fazla analiz etmek için örneği taramalı elektron mikroskopisi için hazırlayın. Parlatma ve ilk optik mikroskopi incelemesinden sonra, içsel örnek özellikleri, ışık mikroskopisi altında tanımlanan bölgenin mikro bilgisayarlı tomografi veri setindeki ilgili konumla eşleşmesine olanak sağladı. Polarize ışık mikroskopisi, önceden var olan kemiği (mavi renkle gösterilen) iyileşme sırasında oluşan yeni oluşan kemikten (turuncu renkte) ayırt etti.

Daha yüksek büyütme polarize ışık mikroskopisi, kemiklerin önceden var olan kortikal kemikle çok zıt olarak büyüdüğü, ince bir bölgede dik konumlanmış Tip I kollajen liflerinin bulunduğu bir arayüz ortaya koydu. Taramalı elektron mikroskopi görüntüleme, ilgi alanlarının hassas lokalizasyonunu mümkün kıldı. Seçilen bölgenin bir hacmi dilim-görüntü tomografisi kullanılarak daha ayrıntılı incelendi.

Hendek yüzeyi, büyüyen bir trabekülde kemik morfolojisini gösteriyordu. Geçirim elektron mikroskobi, kemik-biyomateryal arayüzünün nano ölçekli incelenmesini sağlar ve bu yöntem seçilmiş alan elektron difraksiyonuyla birleştirilebilir. Seçilmiş alan elektron kırınımlama desenleri, hem biyomateryal bölgesinin hem de kemik bölgesinin hidroksiapatit kristallerinden oluştuğunu gösterdi.

Görüntülenen arayüz bölgesinin enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi haritalamasında fosfor ve kalsiyum gösterildi. Bu çok modlu iş akışı, tek bir görüntüleme tekniğiyle elde edilemeyecek tamamlayıcı içgörüler sağlar. Bu iş akışı önemli zaman, teknik uzmanlık ve özel enstrümantasyona erişim gerektirir.

Fonksiyonel korelasyonları, uzun vadeli kemik yenilemesini ve biyomateryal tasarımını araştırabilir.