Name: Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Keşfedin optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal mikroskopi ile DNA-PAINT kullanarak tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme. Bu yöntem özel optik gerektirmeden yüksek çözünürlüklü hücresel yapıları incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. 236, Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore-DNA+labels+for+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-Hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilik asit</td><td>Merck&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>3,4-Dihidroksibenzoik asit&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60& Times; Apo NA 1.49 objektif lens</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA spin tuz çözme kolonu boyut dışlama reçinesi içerir&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>89882</td><td>Zeba Spin Desalting Columns for step 2.4</td></tr><tr><td>Accutase - Enzim Hücre Ayrılma Ortamı</td><td>Promo Cell</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP ve özel DNA (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>Büyük Fotonik</td><td>Özel ürün</td><td>Drosophila için anti-GFP nanobody</td></tr><tr><td>Alpaka sdAb (1H1) anti-GFP ve DNA kombinasyonu</td><td>Büyük Fotonik</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3</td><td>NUP için anti-GFP nanobody</td></tr><tr><td>Anti-alfa tubulin (YL1/2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG</td><td>Büyük Fotonik</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, İkincil sdAB F2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR&zeta; (6B10.2)</td><td>BioLegend</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Merck&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Konik santrifüj tüp 15 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>Konik santrifüj boru 50 mL</td><td>VWR International</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>Nikon</td><td></td><td>SDC-OPR mikroskobu</td></tr><tr><td>Spin kolonlarının Sephadex G-25 ile tuzdan arındırılması (DNA arıtması için boyut dışlama reçinesi)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11743309</td><td>Marka: Cytiva. 2.5. adım için G-25 sütunları</td></tr><tr><td>D-glukoz</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medyası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Ansusuz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; (Ditiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Marck</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>Serva</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>MP Biyomedikal</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>Maleimide-PEG2-succinimidyl&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>McCoy'un 5A medyası</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-(N-morfolino)etansülfonik asit)</td><td>Merck</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri 0.5 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrohacimli UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartiküller 90 nm -Altın</td><td>Sitodiagnostik</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Orca Fusion-BT cmos kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisillin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>Notlar</td></tr><tr><td>Fosfatla tamponlanmış tuzlu (1x çözelti)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pierce 16% formaldehit (w/v), metanolsüz</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>&nbsp; P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>Sodyum&nbsp; hidroksit</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>TOM20 antikor</td><td>Abcam</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponu</td><td>VWR International</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR International</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltrasyon santrifüj filtre ünitesi, 100 kDa MWCO</td><td>Merck&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>Üretici: Amicon Ultra</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Kuyu Yüksek Cam Taban</td><td>İbidi</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-Slide VI 0.5 Cam Taban</td><td>İbidi</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde dna-paint ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

SDC-OPR sisteminin süper çözünürlüklü görüntüleme yeteneklerini göstermek için (Şekil 1A), düzlem içindeki çözünürlüğü, biyolojik referans yapısı olan nükleer gözenek kompleksleri (NPC'ler) üzerinde DNA-PAINT görüntüleme deneyleri (Şekil 1B) yapılarakdeğerlendirildi 17. Şekil 1C, U2OS hücrelerinde monomerik güçlendirilmiş yeşil floresan protein (mEGFP) ile etiketlenmiş ve DNA ile konjuge edilmiş anti-GFP nanokorlarıyla etiketlenmiş nukleoporin 96 (Nup96)'nın temsilci DNA-PAINT SDC-OPR görüntüsünü göstermektedir. Yakınlaştırılmış paneller NUP alt yapısını ortaya koymakta olup, Şekil 1D, oklarla gösterilen, nükleer gözeneklerin beklenen 8 katlı simetrisiyle uyumlu eşleşmiş Nup96 proteinlerini gösterir. Şekil 1E'de, Nup96 çiftleri arasındaki Öklid mesafesi, bunların hizalanmasıyla ve toplanan görüntünün kesitsel histogramı çizilerek ölçüldü (n = 16 çift). Analiz, EM modelleri ile HILO ve TIRgörüntüleme 23 sonuçları ile uyumlu olarak (13 ± 2) nm (Şekil 1E) bir tepeden tepeye ayrılma göstermiştir. Her zirve uyumu 4 nm standart sapma gösterdi ve SDC-OPR üzerinde DNA-PAINT kullanılarak elde edilen yüksek lokalizasyon hassasiyetini (σSMLM = 3.3 nm, NeNA = 4.4 nm) doğruladı. Dikkat çekici olarak, bu hassasiyet tüm 53 × 53 μm² FOV boyunca korunmuştur ki bu, konfokal tabanlı sistemler için olağanüstü bir özelliktir.
Çok renkli görüntüleme yeteneğini göstermek amacıyla, U2OS hücrelerindeki Nup96, mitokondriler ve mikrotübullar, Exchange-PAINT18 kullanılarak alınmak üzere DNA etiketiyle belirlendi. Bu teknik, tek bir florofora konjuge edilmiş ortogonal DNA görüntüleme zincirleri kullanır ve tüm hedeflerin aynı lazer kaynağıyla uyarılmasını sağlar (Şekil 2A). Sinyalleri aynı anda almak yerine, bunları ardışık görüntüleme turları arasında ayırarak ticari SDC-OPR sistemine doğrudan entegrasyonu kolaylaştırır. Şekil 2B, anti-GFP nanobody ile mavi etiketlenmiş Nup96, ikincil anti-TOM20 antikorlu kırmızı mitokondriler ve birincil anti-α-tubulin antikoru ile yeşil mikrotübullar gösterilmiştir. Özellikle, tek renkli Nup96 görüntülemesi için elde edilen olağanüstü tek moleküllü lokalizasyon hassasiyeti, çoklu hedefli deneyde tüm hedeflerde korunmuş ve NPC için 3,9 nm, α-tubulin için 4,0 nm ve mitokondriler için 3,3 nm lokalizasyon hassasiyeti değerleri elde edilmiştir (Şekil 2B panelleri 1, 2 ve 3).
Büyük FOV görüntüleme için, HeLa hücrelerindeki mikrotübullar, SDC-OPR sisteminde bulunan çeşitli büyütmeler ve farklı kamera binleme ayarlarıyla görüntülenerek piksel boyutlarını 78 nm ile 108 nm arasında tuttu (Şekil 3). Şekil 3A, 10 HeLa hücresinin mikrotübul sitoskeletini gösterir ve renkler lokalizasyon hassasiyetini temsil eder. 1× büyütmede, ortalama lokalizasyon hassasiyeti daha yüksek büyütmelere (Şekil 3B-D) kıyasla belirgin şekilde daha kötüdür ve daha fazla değişkenlik gözlemlenir. Bu, Gauss aydınlatma profilinin belirgin olduğu ve FOV'un kenarlarına doğru hassasiyetin azaldığı büyük FOV üzerindeki lazer güç yoğunluğunun azalmasından kaynaklanır. Buna rağmen, geniş 211 × 211 μm² FOV boyunca ortalama 9,5 nm lokalizasyon hassasiyeti elde etmek, konfokal tabanlı sistemler için etkileyicidir ve biyolojik heterojenliğin yüksek çözünürlüklü araştırılmasını mümkün kılar.
Son olarak, sistemin en yüksek büyütme (4×, 53 × 53 μm² FOV) kullanılarak sabit HeLa hücrelerinde mikrotubul ağının DNA-PAINT görüntüleri alınarak ~500 nm kalınlığında konfokal hacmde ve 1 μm z-adım elde edilerek tüm hücrelerin görüntülenme olasılığı gösterilmiştir. Şekil 4A, her z-düzlemi için tek moleküllü yeniden yapılandırma görüntülerini, ilgili lokalizasyon hassasiyeti ve NeNA değerleriyle birlikte sunar. Ayrıca, HeLa hücresindeki mikrotübul ağının 3D renkli görselleştirmesi Şekil 4C'de sunulmaktadır. Derinlik arttıkça, saçılma ve optik aberrasyonlar nedeniyle tespit edilen foton sayısı azalır; bu da hem Cramér-Rao Alt Sınırı (CRLB) (Şekil 4A, sağda) türetilen lokalizasyon hassasiyetleri hem de NeNA metriğiyle hesaplananlar için lokalizasyon hassasiyetinin azalmasına yol açar. Yine de, SDC-OPR sisteminin mümkün olan yüksek foton toplama seviyesi, dar dağılımlarla 9 μm'ye kadar görüntüleme derinliğinde 10 nm σSMLM ≤ olanak tanır. Gerçekten de, çift duvarlı filamentli mikrotübul yapıları çeşitli derinliklerde açıkça çözülmüştür: örtü-slip hücre arayüzüne yakın, ara eksenel pozisyonlarda ve hücrenin üst kısmında, tepeden tepeye mesafe 30 nm ile 40 nm arasında (Şekil 4C), bildirilendeğerler 24 ile tutarlıdır. Bu sonuçlar, SDC-OPR'nin büyük FOV'lar ve tüm hücre yüksekliği boyunca yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlama yeteneğini ortaya koymaktadır.
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Şekil 1: Farklı hücre örneklerinin düzlem içi tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi ve çok renkli süper çözünürlüklü görüntüleme. (A) Optik Foton Yeniden Ataması (SDC-OPR) sistemiyle dönen disk konfokalının şeması, foton toplama kapasitesini maksimize etmek için tasarlanmış mikrolens dizisi içerir. (B) DNA-BOYA'nın şeması: Floresan olarak işaretlenmiş DNA zincirleri, görüntüleyici zincirleri olarak bilinen, ilgilenilen proteini hedefleyen antikor/nanokora sabitlenen tamamlayıcı DNA dizileriyle (kenetlenen zincirler) geçici olarak hibritleşir. Bu kısa ömürlü bağlanma olayları, stokastik yanıp sönme şeklinde görünen floresans sinyalleri oluşturur. (C) U2OS hücrelerinin NPC'sinin 4× büyütülmesiyle SDC-OPR sisteminde temsil DNA-PAINT görüntüsü. Yüksek çözünürlük yeteneği, bireysel NPC'lerin net şekilde çözüldüğü inset bölümünde gösterilir. (D) SDC-OPR ile geliştirilmiş DNA-PAINT, beyaz okların gözenek mimarisindeki karakteristik Nup96 protein çiftlerini vurguladığı tek NPC'lerin görselleştirilmesini sağlar. (E) Nup96 dimerler (n=16 çift) arasındaki mesafe ölçümlerinin tek NPC simetri birimleri içinde dağılımı. Bu şekil, Zaza ve ark.14'ten değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Şekil 2: SDC-OPR mikroskobu kullanarak çok renkli görüntüleme için Exchange-PAINT. (A) Üç hedefin Exchange-PAINT şeması sıralı olarak görüntülendi. Üç protein hedefi DNA fonksiyonel antikorlar, Fab parçaları veya nanobody ile etiketlendi. Cy3B görüntüleyici iplikleri, görüntüleme turları arasında yıkama adımları ile iplik tipine göre sıralı olarak görüntülendi. (B) U2OS hücrelerinin SDC-OPR mikroskopisi ile 4× büyütme ile üç renkli Exchange-PAINT görüntülemesi, mikrotubullar (kırmızı; DNA ile bağlanmış anti-α-tubulin ile etiketlenmiş), mitokondriler (yeşil; TOM20 hedefleyen DNA-nanobody) ve NPC (mavi; mEGFP etiketli Nup96, anti-GFP DNA-nanobody ile). Ölçek çubuğu: 5 μm. Yakınlaştırılmış bölge, SDC-OPR sisteminde elde edilen gelişmiş çözünürlüğü vurgular; (1) mitokondriler, (2) mikrotübullar ve (3) NUP'a odaklanır. Ölçek çubukları = 1 μm. Bu şekil, Zaza ve ark.14'ten değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Şekil 3: SDC-OPR mikroskobunda büyük FOV'larda DNA-PAINT görüntüleme. Mikrotubul DNA-PAINT görüntüleri (anti-α-tubulin etiketleme) çoklu büyütmelerde elde edildi: (A) 1× büyütme ve 1 binleme (FOV 211 × 211 μm²), (B) 2.8× ve 2 binning (FOV 76 × 76 μm²), (C) 4× büyütme ve 4 binleme (FOV 53 × 53 μm²). Renk, 1x büyütme durumunda 0-16 nm arasındaki lokalizasyon hassasiyetini, diğerlerinde ise 0-4 nm arasındaki konumlandırma hassasiyetini temsil eder. (D) Farklı mesafelerde (μm cinsinden) 1× (kırmızı), 2,8× (sarı) ve 4× (yeşil) büyütmeler için lokalizasyon hassasiyeti ölçülür. Bu şekil, Zaza ve ark.14'ten değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Şekil 4: Tüm hücre DNA-PAINT görüntülemesi. (A) Sol. SDC-OPR ile elde edilen DNA-PAINT ile HeLa hücrelerinde hacimsel mikrotubul görüntüleme, 4× büyütme ile z = 0 ile 9 μm (1 μm adım) arasında eksenel kesitler gösterilmiştir. Her düzlem z konumu, lokalizasyon hassasiyeti ve NeNA metriklerini gösterir. Ölçek çubukları: 5 μm (xy). Doğru. Tüm uçaklar için yerelleştirme hassasiyeti ve nüfuz derinliği arasındaki fark. (B) (A)'daki aynı HeLa hücresinde mikrotübul ağının 3D render edilmesi. Renk, 0 ile 9 μm arasındaki nüfuz derinliğini temsil eder. (C) (A)'da belirtilen her penetrasyon derinliğinden vurgulanmış küçük bölgelerin yakınlaştırılmış görüntüleri. Bu şekil, Zaza ve ark.14'ten değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

Protokolümüz, derinlik sınırlamalarını aşmak için optik foton yeniden ataması ile dönen disk konfokal mikroskop üzerinde DNA-PAINT kullanıyor. DNA-PAINT artık çoklu kanallar ve nicel yeteneklerle son derece yüksek çözünürlük seviyesine ulaşıyor ve PALM ve STORM gibi diğer SMLM tekniklerini geride bırakıyor. Başlamak için, optik foton yeniden atama ünitesi ve sCMOS kamera ile donatılmış dönen disk konfokal sistemi kullanın.Sistemi görüntülemeden 30 dakika önce mikroskopu, kamerayı ve lazerleri açarak başlatın. Sonra bilgisayarı çalıştır. NIS-Elements yazılımının tam olarak yüklenmesini bekleyin.Şimdi, satın alma parametrelerini ayarlamadan önce SoRa Dönen Disk seçerek NIS-Elements'te uygun görüntüleme modunu seçin. Tek moleküllü olayların en üst düzeye çıkarılması için 60x sayı açıklığı 1.49 yağ daldırma hedefini seçin. Sonra, hedef, kamera ayarları ve örnek temelinde uygun büyütmeyi seçin.Kamera bükülmesini seçilen büyütmeye uygun şekilde ayarlayın. DNA-PAINT alımı için maruz kalma süresini ayarlayın. Şimdi, lazer dalga boyunu, lazer gücünü ve filtre çarkını görüntüleyici boya spektrumuna göre yapılandırın.Objektif sonrası lazer gücünü kaydetmek için, örnek düzleminin yakınındaki mikroskop aşamasına kalibre edilmiş bir lazer güç ölçer sensörü yerleştirin ve ölçülen gücü kaydedin. Sonra, temiz 60x Apo'nun sayısal açıklığı 1.49 yağ hedefine bir damla daldırma yağı uygulayın. Hazırlanan immünboyalı hücre örneğini, kaymayı en aza indirmek için bir aşama adaptörü kullanarak mikroskop aşamasına sabitleyin.Parlak alan moduna geçin ve nanopartikülleri referans olarak kullanarak cam düzlemine odaklanın. Sonra edinim sırasında odaklanmayı korumak için Mükemmel Odak Sistemi'ni aktive edin. Mükemmel Odak Sistemi aktifken, uyarıyı geçici olarak yeşil floresan protein kanalına değiştirerek optimal odak düzlemini belirleyin.Bu aşamada düşük lazer gücü kullanın. Deney adını ve kayıt yolunu tanımlayın. Zaman kutusunu işaretleyerek aralığı, süreyi ve döngü sayısını ayarlayın.Aralığı Gecikmesiz olarak ayarlayın ve toplam kare sayısına karşılık gelen döngü sayısını girin. Alttaki PFS kutusunun seçildiğinden emin olun. Daha önce tanımlanmış SoRa uyarıma ayarlarına geri dönün ve Şimdi Çalıştır'a basın.İlk protein için 15.000 ila 20.000 kare elde edinin, 300 milisaniyelik bir entegrasyon süresi kullanılarak. Görüntü analizi için, karmaşık görüntü yığınını Picasso lokalize modülüne yükleyin. Menü çubuğundan Analiz ve ardından Parametreler'i seçin ve üretici spesifikasyonlarına göre kameraya özgü parametreleri girin.Sonra, tek molekül lokalizasyon hassasiyetini optimize etmek için kutu kenarı uzunluğunu yedi olarak ayarlayın. Uygun minimum net gradyan değeri seçin ve tespit edilen yerelleştirmeleri görselleştirmek için önizlemeyi etkinleştirin. Arka plan tespitini en aza indirmek için gradyan eşiğini ayarlayın.Şimdi, Analiz ve ardından Lokalize seçeneğini seçerek tüm karelerde nokta tanımlama ve uyum işlemlerini başlatın. Ortaya çıkan hdf5'i Picasso Render modülüne yükleyerek yeniden oluşturulan yerelleştirme haritasını görselleştirin. Postprocess seçin ve ardından RCC ile Undrift'i seçin.1.000'den başlayan bir segmentasyon değerini girerek xy sürüklenme grafiki elde edin. Drift düzeltmesini iyileştirmek için daha düşük segmentasyon değerleriyle tekrarlayın. Kayma düzeltilmiş yerelleştirme dosyasını kaydetmek için Dosya ve Kayd Yerelleştirme seçeneğine tıklayın, ardından render modülünü kapatın.Şimdi, drift düzeltmeli dosyayı Picasso Filtre modülüne yükleyin ve yerelleştirme hassasiyeti, nokta yayılım fonksiyonu genişlikleri, foton sayıları ve diğer kalite metriklerine dayalı eşikler uygulayın. Filtrelenen yerelleştirme dosyasını kaydetmek için File and Save Localization seçeneğine tıklayın, filtre modülünü kapatmadan önce. U2OS hücrelerinde monomerik güçlendirilmiş yeşil floresan protein ile etiketlenmiş nukleoporin 96'nın DNA-PAINT görüntülemesi, görüş alanında net, süper çözünürlüklü bir nükleer gözenek kompleksi deseni oluşturdu.Yakınlaştırılmış görüntülerde, beklenen sekiz kat nükleopori gözenekleriyle sıralanmış çift nukleoporin 96 alt birimleri ortaya çıktı. Hizalanmış nukleoporin 96 çifti arasındaki Öklid mesafesinin ölçümü, tepeden tepeye 13 artı veya eksi 2 nanometre uzaklık gösterdi. Nukleoporin 96, mitokondriler ve mikrotübullar, U2OS hücrelerinde tüm hedeflerde korunmuş tek molekül lokalizasyon hassasiyetiyle aynı anda görselleştirildi.Geniş görüş alanı HeLa hücrelerindeki mikrotubulların görüntülemesi, lokalizasyon hassasiyetinin büyütme ve alan boyutuna göre değiştiğini, daha düşük büyütmede hassasiyetin azaldığını gösterdi. Daha yüksek büyütmeler, 1x büyütmeye kıyasla daha iyi ve daha eşit bir konumlandırma hassasiyeti sağladı. Tüm hücre görüntüleme, mikrotubul ağının DNA-PAINT ile tüm hücre derinliğini kapsayan birden fazla eksenel düzlem üzerinden alınmasıyla gösterilmiştir.Lokalizasyon hassasiyeti, görüntüleme derinliği arttıkça yavaş yavaş azaldı. Çift duvarlı mikrotübul yapıları, tepeden tepeye 30 nanometre ile 40 nanometre arasında olan çoklu eksenel konumlarda çözüldü. Protokolümüz, derin hücre ve doku DNA-PAINT görüntülemesini çözünürlükten ödün vermeden, basit ve ticari olarak mevcut optikler kullanarak gerçekleştirir.Yüksek çözünürlüklü DNA-PAINT esas olarak TIRF veya yüksek aydınlatma altında çalışır ve görüntüleme derinliğini sadece birkaç mikron ile sınırlar. Bulgularımız, DNA-PAINT'i birçok laboratuvara erişilebilir hale getiriyor ve derinlikteki hücrelerde ve dokularda nano ölçekli görüntüleme yapılmasını mümkün klıyor.

whole-cell-super-resolution-imaging-via-dna-paint-on-spinning-disk

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Biz fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM)-tabanlı sabit, kültürlü nöronlar kesecikler çalışmaları nasıl uygulanacağını açıklar. Bizim protokol anahtar bileşenleri süper çözünürlüklü mikroskopi sistemi ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplamak ve bir süper-çözünürlük görüntü üretmek için ham görüntüleri işlerken photoconvertible kimeralar ile etiketleme veziküller içerir.

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Canlı hücrelerin içindeki dinamik proteinler hakkındaki uzay-zamansal bilgi, biyolojiyi anlamak için çok önemlidir. Hızlı 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (f3D-SIM) adı verilen bir tür süper çözünürlüklü mikroskopi, bakterilerdeki sitokinetik Z halkası hakkında benzersiz bilgiler ortaya çıkarır: hem boncuk benzeri görünümü hem de halka içindeki FtsZ'nin hızlı dinamikleri.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Bu iletişim kuralı süper çözünürlük ışık mikroskobu birleştiriliyor ve elektron mikroskobu görüntüleri taramak Zebra balığı retina üzerinde hücre altı protein yerelleştirme sonuçları elde etmek için gerekli adımları açıklar.

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

Bu makalede bir veya daha fazla plazma ve/veya zemin durumu tükenmesi (GSD) süper çözünürlük mikroskobu memeli hücrelerinde kullanarak hücre içi zar proteinleri tespiti için bir protokol özetlenmektedir. Burada, faydaları ve görselleştirme ve proteinlerin miktar için bu tür yaklaşımlar kullanarak konuları tartışmak.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve monte edilebildiğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini açıklar.

Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi

Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Süper çözünürlüklü mikroskopi, mayozdaki sinaptonemal kompleks içindeki bileşenlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bir fikir verebilir. Burada, Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleksinin bireysel proteinlerini çözmek için bir protokol gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans Germline İçindeki Sinaptonemal Kompleksin Süper Rezolüsyonlu Mikroskopisi

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü hücresel ve alt hücresel görüntüleme için çoklu dizi dedektörüyle entegre edilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop sisteminin gelişmiş görüntüleme uygulamalarını ve paylaşılan kaynak yönetimini detaylandırır. Bu iş akışı, tek bir platform içinde konfokalden süper çözünürlükle (~120 nm) çok modal görüntülemeyi mümkün kılarak nano ölçekli görselleştirmeyi daha erişilebilir kılar.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Keşfedin optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal mikroskopi ile DNA-PAINT kullanarak tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme. Bu yöntem özel optik gerektirmeden yüksek çözünürlüklü hücresel yapıları incelemeyi kolaylaştırır.

Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme

Daha fazla video keşfet