Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Diyabetin genetik temelini anlamak için kök hücre kökü gözlükleri kullanarak insan endokrin pankreas gelişimini inceliyoruz. Geleneksel böbrek kapsül nakli oldukça invazivdir. Kas içi nakil protokolü daha basit, tekrarlanabilir ve minimal invaziv bir alternatif sunar.

Başlamak için, ters piramidal mikrokuyular içeren 24 kuyruklu mikrokuyu plakasının altını kapatmak için %5 yapışma karşıtı çözelti 0,5 mililitre ekleyin. Plakayı 1,300 g sıcaklıkta oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin. Sonra mikro kuyular hava kabarcıkları için mikroskop altında inceleyin.

Plaka yeniden santrifüj edildikten sonra, hapsolan havayı çıkarmak için anti-yapışkan çözeltiyi aspire edin. Sonra her iki parçayı 0,5 mililitre PBS ile iyi yıkayın ve yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. Sonra, hPSC'lerden geliştirilen kültürlenmiş pankreas öncüllerini 0,5 milimolar EDTA ile bir mililitre PBS ile yıkayın.

PBS'yi 0.5 millimolar EDTA ile aspire edin ve kuyuları tripsin ile örtün. Sonra 37 derece Celsius'ta sekiz ila 12 dakika kuluçka yapın. Tripsini iki hacim DMEM/F12 veya PBS ile seyreldin ve hücreleri pipetle nazikçe yeniden askıya alın.

Süspansiyonu konik bir tüpe aktarın ve hemen bir sonraki adıma geçin. Süspansiyonu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 200 gramda santrifüjlendirin. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve peleti önceden ısıtılmış S4 ortamında nazikçe tekrar askıya alın.

Sonra, mikro kuyu çanaklarından PBS'yi aspire edin. Mikro kuyu plakasının her kuyusuna 1,25 mililitre askıda kalmış hücreleri nazikçe ekleyin. Plakayı 100 g oda sıcaklığında üç dakika boyunca santrifüjlenerek hücrelerin mikro kuyruklarda eşit şekilde dağıtılmasına izin verin.

Mikro kuyu plakasını dikkatlice nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine aktarın. Farklılaşma ortamlarıyla ortam değişiklikleri yapmak için, medyayı kuyu duvarları boyunca nazikçe aspire edip dağıtarak türbülansı ve hücre kümelerini mikrokuyulardan yerinden etmeyi önler. Üretilen kümelerin uygun miktarını 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktardıktan sonra, şırıngayı iğne boru montajına bağlayın ve S7 ortamı ile doldurun.

Kümeleri mikrosantrifüj tüpünden doğrudan boruya aspire edin. Boru ikiye katlayın ve katlanmış bölümü 200 mikrolitrelik pipet ucuna yerleştirin. Sonra uç tüplü iğne montajını 15 mililitrelik konik bir tüpün içine yerleştirin ve uçlarını bantla tüpün kenarına sabitleyin.

Tüpü 100 g ile iki dakika boyunca 4 derece Celsius'ta santrifüjlenerek kümeleri sıkıştırın ve tüpü hemen buz üzerine yerleştirin. Kümeleri anestezi edilmiş NOD scid gamma farelerine nakletmek için, sağ bacağın medial kısmı dizin altındaki kısmı tıraş edilip %70 etanol ile dezenfekte edilir. Sonra boruyu pipet ucundan ayırın ve şırıngaya bağlayın.

Boruyu sıkışmış kümelere yakın kesin ve iğnenin kör ucuna takın. Salini ilk küme iğnenin ucuna ulaşana kadar itin. Sonra fareyi yabu, sağa yaslanıp sağ bacağı uzat.

İğneyi, sağ uyluğun medial bölmesine, adduktör ve gracilis kasları arasındaki bölüme dört ila beş milimetre derinliğinde sokuyun. Sonra iğneyi yaklaşık üç milimetre geri çekerek kümeleri enjekte edin. Şırıngayı döndürün, iğneyi çekin ve farenin toparlanmasına izin verin.

Transplantasyon ve doku kesitinden altı hafta sonra greft iyileşmesinin ardından, sonraki görüntüleme analizlerini mümkün kılmak için immünboyama işlemi yapılacaktır. Dördüncü aşama pankreas öndelerinin tek hücreli süspansiyonları, boyut kontrollü üç boyutlu agregalar oluşturmak için mikro kuyu plakalarına yerleştirildi. 24 ila 48 saat içinde kompakt küresel kümeler oluştu.

Flüoresans mikroskobi, raporlayıcı hPSC hatlarında PDX1 ve insülin ekspresyon hücrelerinin varlığını doğruladı. Altı hafta sonra, greft bölgesi kas içinde tespit edilebilen göz deliği benzeri kütlelerle makroskopik olarak görselleştirildi. Eksizyon sonrası, eksplantlar stereo mikroskop altında soluk küresel bağlam yapıları olarak tanımlanabiliyordu.

Nakil edilen hayvanlarda C-peptid pozitif hücrelerin sağlam bir şekilde tespit edilmesi gözlemlenmiştir. İnsülin boyama, greftte insan beta benzeri hücrelerin varlığını doğruladı. Glukagon ve somatostatin pozitif hücreler tespit edildi, bu da alfa ve delta hücre popülasyonlarının korunduğunu göstermektedir.

Bu protokol, nakil edilen insan greftlerinin in vivo fonksiyonel testleri ve hayatta kalma ile olgunlaşma değerlendirmelerini kolaylaştırır. En önemli husus, küme oluşumu sırasında yüksek kaliteli kök hücre farklılaşması ve nazik hücre yönetiminin sağlanmasıdır; böylece canlı kalma ve iyi hücre hayatta kalma sağlanır. Bu modeller, monojenik diyabet ve beta hücre işlev bozukluğunun altında yatan genetik mekanizmaların sorgulanmasını kolaylaştırır.