MLV tabanlı psödovirüsler kullanılarak SARS-CoV-2 giriş inhibitörlerinin potansiyel antiviral olarak tanımlanması için prosedürler

Araştırmamız, pseudovirüs sistemleri kullanarak SARS-CoV-2 girişini engelleyen inhibitörleri belirlemeye odaklanmaktadır. SARS-CoV-2 girişinin incelenmesi genellikle yüksek biyogüvenlik koruma laboratuvarları gerektirir, genellikle BSL-3. Bu protokol, standart BSL-2 laboratuvarlarında psödovirüslerde kullanılan güvenli antiviral taramayı mümkün kılar.

Başlamak için, biyogüvenlik kabine altı delikli doku kültürü plakası yerleştirin ve iki mililitre tam ortamda beş HEK 293 türevli hücre gücünde 7,5 kat 10 tohum ekleyin. Plakayı gece boyunca %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta kuluçkaya geçirin. Ertesi gün, hücrelerin yaklaşık %50 ila 60 birleşimine ulaştığını doğrulayın.

Ertesi gün, polietilen veya PEI çözeltisini, 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde 50 mikrolitre azaltılmış serum ortamına 50 mikrolitre, mililitrede bir miligram PEI stoku ekleyerek hazırlayın. Ayrı bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde, aynı ortamın 50 mikrolitresine 2,5 mikrogram GFP ifade eden plazmid ekleyerek DNA çözeltisi hazırlanır. Her tüpü kısa bir süre vorteksle karıştırın, ardından beş saniye boyunca aşağı döndürün ve oda sıcaklığında kuluçka yapın.

10 dakikalık kuluçka döneminde, altı delikli plakanın her kuyusundan hücre monokatmanını bozmadan dikkatlice alın ve her kuyuyuga antibiyotiksiz tam transfeksiyon ortamı bir mililitre ekleyin. İnkubasyondan sonra, PEI çözeltisi içeren tüpe 50 mikrolitre DNA çözeltisi eklenin. Altı kez pipetle hızlıca karıştırın ve oda sıcaklığında tam üç dakika kuluçka yapın.

Sonra PEI DNA kompleksini ilgili kuyuya damla olarak hızlıca ekleyin. Şimdi, plakanın sınırlarını parafilm ve santrifüj ile 1000 G'de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kesinti olmadan bir salınım rotor ve bir plaka kovası ile mühürleyin. Santrifüjlemeden sonra, parafilmi nazikçe çıkarın ve plakayı 37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit ile üç saat boyunca kuluçka yapın.

Sonra her kuyruktaki transfeksiyon ortamını nazikçe iki mililitre önceden ısıtılmış tam DMEM ortamıyla değiştirin. Transfekte edilen hücreleri %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius sıcaklıkta 48 saat boyunca kuluçka edinin ve floresan mikroskopisiyle GFP ekspresyonunu değerlendirerek transfeksiyon verimliliğini değerlendirin. Tohum HEK 293T, hücreleri daha önce gösterildiği gibi iki 6 delikli plakaya türetmiştir.

Bir plaka SARS-CoV-2 spike pseudo virüs üretimi için, diğerini ise VSVG sahte virüsleri için belirle. Transfeksiyon karışımını ve PEI DNA komplekslerini deney gününde hazırlayın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın. İnkubasyon sırasında, hücre monotabakasını bozmadan altı kuyu plakasının her birinden ortamı dikkatlice çıkarın.

Her kuyuya antibiyotiksiz bir mililitre önceden ısıtılmış tam transfeksiyon ortamı yavaşça ekleyin, böylece ortamın kuyunun duvarından aşağı akmasına izin verin. Hazırlanmış transfeksiyon komplekslerini hücrelere ekleyerek daha önce gösterildiği gibi transfeksiyon yapın. Transfeksiyon sonrası 48 saatlik kuluçkadan sonra, her kuyunun süperatantlarını 50 mililitrelik steril konik santrifüj tüpüne toplayın ve 290 G'de dört derece Celsius'ta yedi dakika boyunca santrifüj yapın.

Hücresiz süpernatantı toplayıp steril 0,45 mikrometrelik poliviniliden florür üst şişe filtre ünitesinden geçirin. Filtrelenmiş süpernatanttan bir mililitre aliquot hazırlayın ve bunları 2,5 kez 10 Hz dört HSI hücresinin gücünde en az 80 derece Celsius Tohum olarak depolayın; bu hücre yüksek derecede SARS-CoV-2 hassas hücre hattı her kuyu başına 50 mikrolitre tam DMEM'de, 96 delikli bir doku kültür plakasında. Test edilecek her durum için, kıvılcımsız sahte virüs enfeksiyonu ve enfekte olmayan kontroller dahil olmak üzere üçlü kuyular hazırlayın ve etiketleyin.

Plakayı gece boyunca %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta kuluçkaya geçirin. Transdüksiyon gününde, her sahte virüs partisinden bir aliquot buz üzerinde çözülün ve nazikçe ters çevirerek karıştırın; bunlardan biri sivri sivri ucu kontrolün bir aliquotu da dahil. Gerekli sahte virüs hazırlığı hacimlerini doğrudan belirlenen kuyulara ekleyin.

Her kuyunun hacmini tam DMEM ile 150 mikrolitre ayarlayın. Şimdi, plakayı parafilm ve santrifüjle 2,500 G'de oda sıcaklığında 45 dakika boyunca kesintisiz kapatın. Parafilm mühürünü çıkarın ve plakayı %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta 72 saat kuluçka yapın.

İnkubasyondan sonra, üreticinin talimatlarına göre luciferaz testi reaktiflerini hazırlayın. Lusiferaz substratı ve 5X lusiferaz testi liz tamponunu oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika eritin. 5X lusiferaz testi lize tamponunu steril suyla 1X'e kadar seyreltin.

Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın. Sonra, her kuyuya 30 mikrolitre 1X liz tamponu ekleyin. Tabağı bir tabak çalkalayıcısına koyup oda sıcaklığında dakikada 150 devirde 10 dakika çalkalayın.

Hücrelerin tam lizize olduğunu ve ayırt edilemez olduğunu doğrulamak için tam hücre lizisini ters mikroskop altında doğrulayın. Sonra lizatları opak beyaz 96 kuyu bir plakaya aktarın. Her kuyuya 50 mikrolitre lusiferaz substratı ekleyin.

Plakayı nazikçe dairesel hareketle hareket ettirerek kısa bir süreliğine karıştırın ve plakayı luminometreye yerleştirip luminesansı ölçün. Daha önce tanımlandığı gibi, 96 kuyruklu bir plakada her kuyu başına 50 mikrolitre tam DMEM'de dört HSI hücresinin 2,5 katı 10 kuvvetinde tohum ekin. Gece boyunca %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta kuluçka yapın.

Ertesi gün, test edilecek bileşiklerin bir ila üç seri seyreltmesini hazırlayın; örneğin %0,5 dimetil sülfüsit içeren tam DMEM içinde arbidol. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyunun ortamını nazikçe aspire edin. Her kuyuya 50 mikrolitre ilgili bileşik seyreltme ekleyin ve sadece 12. sütun kontrol kuyularına tam DMEM eklenin.

%5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta bir saat kuluçka yapın. Bileşikleri çıkarmadan, aynı bileşik konsantrasyonlarını içeren tam ortamda iyi seyreltilmiş her birine doğrudan 50 mikrolitre SARS-CoV-2 spike pseudo virüsü ekleyin. Plakayı parfilm ile mühürleyin.

Oda sıcaklığında 2.500 G'de 45 dakika boyunca kesintisiz santrifüj yapın. Parfilm çıkarıldıktan sonra, plakayı %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta 72 saat boyunca kuluçka yapın. Son olarak, daha önce gösterildiği gibi bir luciferaz testiyle enfektifliği nicelikle ölçün.

HEK 293T kaynaklı hücrelerin dallanmış PEI ile transfeksiyonu, yaklaşık %70 GFP pozitif hücre elde eden yüksek transfeksiyon verimliliği sağladı. Transfeksiyondan 48 saat sonra. Hassas HSI hücrelerinin azalan SARS-CoV-2 spike pseudo virüsleri veya VSVG pseudo virüsleriyle enfekte edilmesinde, pseudo virüs girdisi arttıkça doz bağımlı bir lüminesans artışı gösterdi.

Spike az sahte virüsler ve enfekte olmayan hücreler çok düşük lüminesans seviyeleri gösterdi. Arbidol bileşiği, sahte virüs girişini engelleme yeteneği açısından test edilmiş ve spike pseudo virüsler tarafından oluşturulan lusiferaz aktivitesinin net doz yanıtı inhibisyonu sağlamıştır; VSVG pseudo virüslerde ise daha az inhibisyon gözlemlenmiştir. Test, tarama amaçlı uygunluğu gösteren 0.54 Z asal faktörü gösterdi.

30 mikromolar seviyesinde başlayan konsantrasyonlarda arbidol ile tedavi, sadece %0,5 dimetil sülfoksit aracı ile işlenmiş hücrelere kıyasla hücre canlılığını anlamlı şekilde etkilemedi. Bu protokol, optimize edilmiş koşullarda yüksek titrli sahte virüslerin üretilmesini mümkün kıldı. Bu, araştırmacıların sahte viral girişini ölçmesine ve SARS-CoV-2 spre aracılı enfeksiyonu engelleyen bileşikleri belirlemesine olanak tanır.

Yüksek transfeksiyon verimliliği, yüksek titrli sahte virüsler üretmek ve sonraki akım testlerinde güvenilir enfeksiyon sinyalleri elde etmek için kritiktir. Bu sistem, yeni ortaya çıkan SARS-CoV-2 varyantlarına karşı giriş inhibitörlerinin yüksek verimli antiviral taramasını ve devalüasyonunu destekler ve diğer virüslerden zarf proteinleri gösteren sahte virüsler üretmek için kolayca uyarlanabilir.