Eşeysiz Amfibi Brassicaceae Türü, Rorippa aquatica'nın Verimli Rejenerasyon Temelli Agrobakteriya Aracılı Dönüşümü

Asexual bitkiler için basit ve ölçeklenebilir bir agrobakteriyel dönüşüm hattının eksikliğini ele alıyoruz ve gen fonksiyonlarının moleküler analizlerini mümkün kılıyoruz. Son zamanlarda, tüm genom ve fizyolojik gen ekspresyonu çalışmaları, rorippa aquatica'yı heterofilik için bir model olarak tanıtmıştır. Kara suya uyumun moleküler temelini incelemek için faydalıdır.

Başlamak için, sağlıklı yaprakları ve tüm kenarları olan iki aylık stok bitkileri seçin. 20x30 santimetre ölçülerinde bir bitki çoğaltma tepsisi hazırlayın, iki kat otoklav kağıt havlu ekleyin. Kağıt havluları düzgünce katlayın ve yüzeyde ince bir su tabakası kalana kadar steril suyla doydurun.

Laboratuvar tezgahının 100 ila 500 mililitre çift damıtılmış su, beklenen yeniden askılanmış aşı hacmine uygun steril kaplar, mikro pipet ve uygun pipet uçlarıyla donatıldığından emin olun. Şimdi, seçilen stok bitkilerinden yaprak tabanından 10 yaprağı makasla hızla çıkarın ve steril su içeren bir Petri kabına yerleştirin. 2,5 saat sonra, resüspansiyon çözeltisi litresine 50 mikrolitre yüzeyaktif madde pipetlenerek %0,005 yüzeyaktif madde konsantrasyonu elde edilir.

Çözeltiyi karıştırmak için matayı nazikçe karıştırın ve aşılamadan sonra ekplant yerleştirmek için hazırlanmış bir çoğaltma tepsisinin erişilebilir olduğundan emin olun. Şimdi bir yaprak abaxile tarafı yukarıya bakacak şekilde yerleştirin. Bir neşter kullanarak, yaprağın orta kaburgası boyunca dik olarak bir santimetre uzunluğunda parçalara ayırın ve bunları aşılama eksplantı olarak kullanılacak döner bir tüp mikserinde kullanılabilecek 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Agrobacterium inoculumu, tüm explant materyalini tam doygunlaştıracak kadar hacimde tüpe dökün. Tüpü döner miksere yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karıştırarak aşılama yapılacaktır. Sonra forseps kullanarak, aşılanmış yaprak ekzplantlarını çözeltiden çıkarın ve doğrudan hazırlanmış çoğaltma tepsisine yerleştirin.

Islanmış ekplantları ayırın ve eşit şekilde yayarak doygun kağıt havluların üzerindeki ince su tabakasına tamamen batmamış olsunlar. Sonra, yayılma tepsisini plastik sargıyla kapatın. Tepsileri karanlık bir ortama yerleştirin ve üç gün boyunca 22 derece sıcaklıkta kuluçka yapın.

Karanlık kuluçka dönemi tamamlandıktan sonra, tepsilerin şeffaf plastik sargıyla kapalı kaldığını doğrulayın. Sonra nem seviyesini korumak için tepsilere gerektiğinde çift damıtılmış su ekleyin. Aşılama tepsilerini bir büyüme odasına aktarın ve vejetatif yayılma koşullarında saklayın.

Yenilenmiş rozet bitkilerini nakil uygunluğu açısından görsel olarak inceleyin. İdeal olanı tespit etmek için en az iki ila üç milimetre uzunluğunda çok sayıda yaprak ve köke sahip sağlam bir kanal varlığını doğrulayın. Sonra, forseps kullanarak sağlam transjenik rozet bitkilerini alın.

Kesilen bitki yetiklerini yabani tip klonal rejenerasyonlar için kullanılan koşullar altında nakil edin. Yakılan rozet bitkisini transgenik yapraklarla temas etmeden dikkatlice kaçınarak kesin. Transgenik yaprağın hemen çevresindeki fazla yaprakları kırpın ve her saksıda bir bitki dikin.

Her nakil bitkiyi gübreledikten sonra iyice sulayın, yaprakları süzün ve bitkileri uygun koşullara yerleştirin. Son olarak, sürgü ve kökü olmayan veya nakil için çok küçük görünen transformantlar içeren explant'ı ürgetme tepsisine geri gönderin. Bu explantları taramaya devam edin ve yeterince büyüdükten sonra nakil yapın.

Bir aylık fidelerimizin çoğu, yani tek bir yaşında, yakut ifadesi desenleri gösterirken, az sayıda tamamen yakut yaprak ifade ediyordu. Olgun altı aylık olarak koruduk, tek bir fidanlarımız kimerik yakut ifadesi gösteriyordu. Bir tek bir fidelerimizden çıkarılan kimerik yakut pigmentli yaprak sektörleri, eşeysiz çoğalma yeteneğine sahipti.

Kesilmiş kimerik yaprak parçaları, eksizyondan sonra iki ila dört hafta içinde tamamen yakut ifade eden veya kimerik bir yaprak bitkilerine yeniden yenileniyor; bir T bir rozet bitki yetişiği ve yenilenme sırasında görünür kök oluşumu sağlanıyor. Bir ay sonra, iki Tone fidanımızın çoğunlukla yakut yaprakları gösterdi. Protokolümüz, steril doku kültürü adımlarını atlar ve tohum veya çiçek içermeyen asexual vejetatif olarak çoğaltılan bitkiler için dönüşüm yenileme boru hattı sağlar.

Rorippa aquatica'da sualtı etilen yolu aktivasyonu üzerine yaptığımız çalışmalar, karasal bitki batma yanıtları hakkında önemli bilgiler sunmaktadır. Yöntemimiz, ışık ve hormon yollarının bu amfibi bitkinin su altında nasıl metamorfoz olmasını sağladığını araştırmaya olanak açıyor.