Lokalize RNAi ve Tıbbi Sülük Ektopik Gen İfadesi

Tıbbi sülük; basitliği, erişilebilirliği ve erken embriyogenezden yaşlılığa kadar birçok farklı deneysel araçla statik olarak tanımlanmış nöronlara sahip olması nedeniyle nörobiyolojik çalışmalar için kullanışlı bir model sistemidir. Embriyonik sülüğün özellikle heyecan verici bir kullanım alanı, incelenen nöronun veya hedeflerinin gen ifadesinde gerçekleştirilen çok hassas modifikasyonların ardından, canlı ve bütün haldeki hayvanda nöronal uzantıların zaman ayarlı görüntüleme çalışmalarıdır. Bu videoda, Alex Grossman'ın laboratuvarı ile laboratuvarımız arasındaki iş birliğiyle geliştirilen pnömatik bir kılcal tabanca kullanarak, sülüğün canlı embriyolarının iç katmanlarına reaktiflerin hızlı, doğru ve oldukça lokalize bir şekilde iletilmesini sağlayan yeni bir teknolojiyi tanıtıyoruz.

Bu teknik, DNA, çift zincirli RNA veya mikroskobik altın partiküllere yüklenebilen herhangi bir başka molekülün iletiminde uygulanabilse de, biz bu yöntemi Axon guidance molecule.Rin'in hem susturulması (knockdown) hem de ifadesinin artırılması (knockin) için kullanacağız. Merhaba, California Üniversitesi San Diego, Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Eduardo Ano laboratuvarındanım. Bugün size, sülüğün tüm vücut segmentlerinin ventral vücut duvarında doğal olarak ifade edilen ancak dorsal alanında ifade edilmeyen Axon guidance molecule networking ifadesini susturma veya artırma prosedürünü göstereceğiz.

Gelişimin erken evrelerinde, seçilmiş segmentlerin vücut duvarı ve ganglionlarına çift zincirli RNA veya plazmit DNA molekülleri ileteceğiz. Pnömatik kapiler tabanca ile yapılan bütünsel iletim, işlem görmemiş segmentleri dahili kontrol olarak bırakarak, alt segmentin seçili bölgelerindeki gen ekspresyon modellerinin bozulmasına olanak tanıdığı için özellikle önemlidir. Ayrıca, dokuya zarar vermeden ve örneği açmadan, gelişimin erken evrelerindeki hücrelerin iç katmanlarına ulaşmak için kullanılabilir.

Son olarak, holistik iletimin, mikroenjeksiyon yoluyla tek hücreli susturma ile genetik yaklaşımlar aracılığıyla sistemik susturma arasında orta bir noktada yer alan, seçili bir konumdaki sınırlı sayıda hücreyi hedefleyebilme avantajı vardır. Öyleyse başlayalım. Tıbbi LE, merkezi sinir sisteminin basitliği, yaklaşık 200 bilateral nöron çifti ve küçük bir dev glia setinden oluşması nedeniyle, sinir hücrelerinin özelliklerini ve davranışla ilişkili nöro devreleri incelemek için uzun süredir kullanılmaktadır.

Sülüğün 21 vücut segmentinin her birindeki segmental ganglion ve her bir nöron, erken embriyo aşamasından yaşlı yetişkinliğe kadar örnekten örneğe tekrarlanabilir şekilde tanımlanabilir ve incelenebilir. Firavunlar zamanından beri sülük, kan alma amaçları için kullanılmıştır ve tıpta sürekli kullanılması, ticari hayvan tedarikçilerinden kolayca temin edilmesini sağlamaktadır. Ancak, sinir sistemi gelişimini çalıştığımız için, laboratuvarımızda deneylerimiz için bize düzenli embriyo kaynağı sağlayan, sayısı birkaç yüzü bulan bir sülük kolonisi beslemekteyiz.

Sülükler hermafrodittir. Hem dişi hem de erkek yapılara sahiptirler ve çapraz döllenme gerçekleştirirler. Bu nedenle tüm örnekler yumurta bırakabilir.

Bunu, vücudun clitellum olarak bilinen bölgesindeki, oldukça ilginç polimerler salgılayan özel bir grup bez aracılığıyla kendilerinin ürettiği koza adı verilen bir yapı içinde yaparlar. Yumurtlamaya hazır bir sülük, tanklarda sağladığımız yosunların içine gömülür ve vücudunun etrafında bu yumurta şeklindeki kozayı oluşturmaya başlar; yeterli materyal salgılandığında ve moleküller polimerize olmaya başladığında, sülük kozanın içine yumurtaları ve besleyici bir sarısını bırakır ve dışarı çıkar. Bir jilet kullanarak, kozanın ucunda bir pencere açarak embriyoları çıkarabiliriz.

Genel olarak, farklılaşmaya başladıkları altıncı günden itibaren her kozda 10 ila 20 embriyo bulunur. Embriyolar kozdan çıkarılabilir ve havuz suyunda yetiştirilebilir. Nöronal gelişim üzerine deneysel çalışmalarımıza genellikle bu evrelerde başlarız.

Bu prosedürdeki ilk ana adım, kaplanmış partiküllerin hazırlanmasıdır. Bu gösterimde, Rin akson yönlendirme molekülünün lech homologunun çift zincirli RNA molekülleri ile kaplanmış altın partiküllerinin lech embriyolarına nasıl iletileceğini göstereceğiz. Hedef hücreler, gövde duvarındaki ventral longitudinal kas hücreleridir ve bu hücrelerin Agenesis'in erken aşamalarından itibaren Rin ekspresyonu gerçekleştirdiği ve bunu salgıladığı bilinmektedir.

Amacımız, gelişim sırasında mümkün olduğunca erken bir aşamada tek bir vücut segmentindeki doğal ekspresyonu baskılamak ve bunun, bu önemli gelişimsel faktöre duyarlı nöronların kategorizasyonlarını nasıl etkilediğini gözlemlemektir. Bu adım için sonikasyon banyosu, vorteks, masaüstü santrifüj ve buz kovası gereklidir. Ayrıca, kullanılmadan önce buz üzerine konulması gereken %100 isopropanol gereklidir.

Mililitre başına 50 miligram vault partikülü içeren 100 mikrolitre bağlama tamponu ile başlayın. Bu partiküller RNAi için tasarlanmıştır ve chell şirketi tarafından üretilmiştir. Ardından, 100 mikrolitre bağlama tamponu ekleyerek partikül çözeltisini seyreltin, kısa süreliğine vorteksleyin ve birbirine topaklanmış olabilecek partikülleri ayırmak için bir ila iki dakika boyunca sonikasyon uygulayın.

İki dakikalık inkübasyonun ardından, partiküllere 5 ila 10 µg çift zincirli RNA ekleyin, vorteksleyin ve iki dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. İki dakika dolduğunda, çift zincirli RNA partikül komplekslerini mikro santrifüjde yaklaşık 15 saniye boyunca minimum 2.500 RPM hızda santrifüjleyin.

Pt elde etmek için, pellet'e minimum düzeyde müdahale ederek süpernatantı uzaklaştırın ve 750 µL izopropanol ekleyin. Mikrosantrifüjde kısa sürelyine döndürün ve döndürme işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın veya altın partikülleri sonikasyon yoluyla %100 soğuk izopropanol içinde süspanse edin. Partikülleri ayırmak için banyo sonikatöründe kısa süreli, iki ila üç darbe uygulayın.

Bir lam üzerine dökün ve solventin tamamen buharlaşmasını bekleyin. En iyi sonuçlar, partiküller dokuya iletilmeden hemen önce kaplandığında elde edilir; bir sonraki adımda size bunu nasıl yapacağınızı göstereceğiz. İstatistiksel transfeksiyona geçmeden önce, deneysel düzeneğe ve bunun nasıl hazırlanacağına bir göz atalım.

Pnömatik kılcal silah, partiküllerin embriyolara hassas bir şekilde iletilmesi için bir mikro manipülatöre monte edilmiştir. Embriyonun yüzeyi bir video mikroskobu ile görüntülenir. Bir yarı iletken lazer, silahın iç kılcal borusu aracılığıyla yönlendirilen ve hedef dokuyu nişan almak için kullanılan bir ışık demeti üretir.

Tabancanın başlığındaki üç girişe bağlanan Titan borularının ayrı hatları, tek bir kaynaktan basınçlı helyum gazı sağlar. Bir hat her zaman açıktır ve böylece tabanca boyunca sürekli bir helyum gazı akışı oluşturur. Diğer iki hat normalde solenoid valf ile kapalıdır ve boru hattına yüklenmiş, iki farklı kaplamaya sahip altın partiküller içerir.

Kuru toz halinde. Tabancanın dış kapiler kısmı, eksi 12,5 PSI gösterge basıncına sahip bir vakum sistemine bağlanır. İstenen partikül penetrasyon derinliğine göre ayarlama yapmak için hi başlık basıncı 10 ile 15 PSI arasında değiştirilir.

Helyum başlık basıncı partikül penetrasyon derinliğini büyük ölçüde etkileyebilir; aynı şekilde embriyonun tabancaya olan uzaklığı da etkileyicidir. Farklı gen tabancaları arasında değişkenlik gösteren nozül çapının, hedef alana göre seçilmesi önemlidir. Deney düzeneğimizi gösterdiğimize göre, şimdi gen tabancamızı dolduralım ve bazı sülük embriyolarını bombardıman edelim.

Titan tüpü doldurulmadan önce, kaplanmış altın partiküllerinin tamamen kuru olması kritiktir. Kaplanmış altın partikülleri, önce bir lam örtüsü veya jilet kullanılarak cam lamlardan sıyrılır ve katlanmış bir peynir altı suyu kağıdına yerleştirilmeye hazır hale getirilir. Tüp, konnektöre yakın bir noktadan U şeklinde bükülmelidir; böylece partiküller doldurulurken tüpün tamamına yayılmayacak, aksine konnektöre yakın bir bölgede yoğunlaşacaktır.

Parçacıkları küçük bir spatula veya V şeklinde bir tartım kağıdı ile alın ve tüpü doldurun. Yükleme aşamasında, parçacıkların eşit şekilde yayılması için tüpe parmağınızla hafifçe vurun. Tüpü doldurduktan sonra, sülüklerimizi hazırlamadan önce Jing tabancası ile çift sarmallı RNA iletimine geçebiliriz.

Burada yaklaşık 10 günlük sülük embriyolarımızı görebilirsiniz. Embriyolar şu anda, çift sarmallı RNA iletiminden önce ve sonra tutulacakları steril ortamda bulunmaktadırlar. Deney embriyolarını çift sarmallı RNA iletimine hazırlamanın ilk adımı, V şeklinde bir oluğu olan esnek silikon bir parçanın üzerine steril ortamda %8 etanol çözeltisi eklemektir.

Bir embriyo eklenir ve partiküller fırlatılmadan hemen önce ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirilir. Odadaki ortam, embriyonun üst yüzeyinin hemen altına indirilir ve embriyoyu sabitlemek ve yüzeyinin kurumasını önlemek için, ortasında küçük bir delik açılmış bir parça doku kağıdı üzerine yerleştirilir; bu işlem aynı zamanda bugün kullandığımız embriyonik evrede yalnızca hedeflenecek alanın açıkta kalmasını sağlar. E 10 evresinde, boyuna kas hücreleri dış yüzeyden yaklaşık 10 ila 20 mikrometre uzaklıkta; epidermisin, dermisin ve dairesel kasların iç kısmında yer alabilir.

Kas hücrelerinin aksine, çalıştığımız E7 ile E12 embriyonik evrelerdeki embriyoların ventral tarafındaki merkezi gangliyonlar, vücudun ventral yüzeyinin yaklaşık 50 mikrometre içerisindedir. Gangliyonlara göre daha yüzeysel bir derinlikte bulunan longitudinal kasları hedeflemek için helyum basıncını ayarlayacağız. Artık altın partikülleri ile longitudinal kasları bombardiman etmeye hazırız.

Yaklaşık yarım miligram ağırlığındaki bir altın partikül yükü, genellikle 10 atıma kadar kullanılabilir ve tek bir atım genellikle birkaç yüz partikül mertebesinde iletim sağlar. Bir atım, valflerden birinin kısa süreliğine 0.3 saniye boyunca açılmasıyla oluşturulur; bu işlem, ilgili boru hattından tabanca namlusuna bir partikül bolusunun enjekte edilmesine neden olur. İlgilenilen doku alanını kapsamak için sıklıkla birden fazla atım gerekir.

Bazı partikülleri yerinden oynatmak ve bunların silah namlusundaki sürekli helyum akışına enjeksiyonunu kolaylaştırmak için atışlar arasında tüpe hafifçe vurulur. Aynı analizde ikinci bir reaktif iletmek istenirse, altın partiküllerinin iletiminden hemen sonra ikinci bir tüpe alternatif partiküller yüklenebilir. Embriyolar, RNAi veya ektopik ekspresyon yeterli kabul edilene kadar, tercihen her kapta bir embriyo olacak şekilde bir ila üç gün boyunca yapay gölet suyuna geri yerleştirilir.

Bu süre zarfında embriyolar, oda sıcaklığında karanlık bir bölmede tutulur. İşte narine, Mr.NA knockdown için bir in situ hibridizasyon analizine bakış. İşlem görmüş embriyoda, az sayıda kas hücresinin terrin ekspres etmediğini görebilirsiniz.

Bu kaslar partiküller içermektedir. Partiküller terrin çift zincirli RNA ile kaplandığında, genellikle hücre başına bir ila iki partikül içeren hücrelerde, narin ekspresyonunda açıkça görülebilir bir knockdowna neden olduklarını görebilirsiniz. Partikülleri GFP kodlayan bir plazmid ile kapladığınızda, kullandığımız pnömatik kapiler tabanca ile çekirdeklerine yerleştirildiklerinde nöronal hücrelerde floresans elde edersiniz.

Bu gösterimde, hedeflenen bölgedeki hücrelere tespit edilebilir bir zarar vermeden, canlı embriyonun küçük lokalize hacmindeki hücrelere her iki partikülü de iletebildik. Ayrıca, göçebe kapiler tabancanın, dokunun üç boyutla sınırlı ve yüksek hassasiyetle hedeflenen mikroskobik bir bölgesinde, dokuya tespit edilebilir bir zarar vermeden gen ekleme (knock-in) ve gen susturma (knock-down) işlemleri için holistik iletim tekniği ve yeni bir yetenek nasıl sağladığını gösterdik. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.