Biyolojik Çıkarma Saha Kiti ve Saha QPCR Birimi kullanılarak Alanda Mikrobiyal DNA Analizi

Araştırmamızın kapsamı, iyileştirme, madencilik, korozyon önleme gibi mikropları karakterize etmek için kullanabileceğimiz moleküler analiz yapmayı ve sürdürülebilirlikle ilgili soruları yanıtlamamıza yardımcı olmayı içeriyor. Bu araştırma, kullanımı kolay ve güvenilir ve sahada taşınabilir moleküler biyolojik iş akışları kullanarak birçok araştırma ve erişilebilirlik eksikliğini gidermektedir. Filtrenin her iki ucunu açın ve üç mililitrelik hava dolu bir şırıngayı filtreye kilitli luer bağlantısı ile bağlayın.

Havayı iterek kalan suyu dışarı atın. Şırıngayı çıkarın ve tekrar etmeden önce daha fazla hava çekin. Sonra, kırmızı çıkış kapağını yeniden kapsağın takılması.

Çözeltiyi karıştırmak için şırıngayı ters çevirin. Luer kilitli şırıngasının kapağını çıkarın ve Solution A şırıngasını kapsüllü 0,2 mikrometrelik filtre girişine Luer kilitleme ucu aracılığıyla bağlayın. Pistonu bastırarak yavaşça Solution A'yı ekleyin. Sonra, kapalı filtreyi beş dakika boyunca güçlü bir şekilde el sıkıştırın.

Şimdi, Çözüm B şırıngasını birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Luer kilitleme kapağını çıkarın ve şırıngayı kapsüllü filtre girişine Luer kilitleme ucu ile bağlayın. Giriş filtresi kapağını kapattıktan sonra, kapalı filtreyi beş dakika boyunca güçlü bir şekilde el sıkıştırın.

Giriş kapağını çıkarın ve filtreyi ters çevirin. Kapsüllü filtre ünitesine bağlı üç mililitrelik bir şırınga kullanarak filtreye bir mililitre hava itin. Sonra, plunger'ı geri çekerek tüm lizatı çıkarın.

Lizat beş mililitrelik bir boncuk tüpüne aktarın. Parafilm ile mühürledikten sonra, boncuk tüpünü beş dakika boyunca sertçe el sıkarak dik konuma getirin. Numune hazırlık kartuşunu düz bir yüzeye yerleştirin ve bir mililitrelik bir şırıngaya Luer kilitlenebilir kolonu takın.

Numune hazırlık kartuşunun ilk bölümüne iki delik açmak için kolonun sivri ucunu kullanın. Boncuk tüpünden bir mililitre lizat pipetle, kartuşun ilk bölümüne yeni açılan deliğe ekleyin. Şırınga kolonunu kartuşun kırmızı bölümüne geri yerleştirin.

Sonra sıvıyı tamamen şırıngaya çekin ve 10 kez dışarı itin. Şimdi, şırınga kolonunun sivri ucunu kırmızı-turuncu bölümün üzerine yerleştirin ve folyo bariyerinden iki delik açın. Pistonu kullanarak, şırınganın tam hacimindeki sıvıyı şırıngaya kadar çekin ve sıvıyı tamamen dışarı pompalayın.

Benzer şekilde, turuncu, sarı, mavi, hava ile kurutulan ve yeşil bölümleri delip pompalamak için şırınga kolonunu kullanarak pistonu bölümde belirtilen sayısı kadar çekip itin. Sonra, yeşil bölümden çıkan tüm çözeltiyi iyi etiketlenmiş bir mililitrelik mikrotüpe aktarmak için bir mililitrelik şırınga ve örnek hazırlama kolonunu kullanın. Saha tabanlı bir qPCR cihazının saf numune tepsisine en fazla üç saha çıkarılmış DNA örneği yerleştirin; böylece belirlenen bölüm başına bir örnek alın.

Her örnek için test şeritlerini, tepsideki ilgili A, B veya C şerit yuvalarına yerleştirin; her şeridin ilk kuyunu, tepsideki ilk yuva ile hizalanın. Telefonun kilidini açın ve tescili qPCR cihazının adını taşıyan uygulamayı açın. Uygulama açıldığında, Çalıştır düğmesine dokunun.

Bir sonraki ekranda, Kimlik Oluştur butonuna dokunun. Örnek bilgisini Örnek Kimliği altına dokunarak ve örnek adını yazarak girin. Örnek birimlerine dokunun ve uygun birimi seçin, ardından örnek miktarının altına tıklayın ve ekstraksiyon sırasında kullanılan hacmi girin.

Tüm örnekler için bilgi girdikten sonra Devam et butonuna dokunun. Bir sonraki ekranda klasör simgesine dokunun ve ardından Güncel Klasöre Kaydet. Bir run name yazın ve Onayla'na dokunun.

Güç düğmesine basıp basılı tutarak tüm ön ışıklar yanana kadar aleti açın. Başvuruda Onay tuşuna basarak devam edin. Uygulamada entegre kısa menzilli kablosuz bağlantı tuşuna basın.

Enstrumandaki entegre kısa menzilli kablosuz düğmeye basın, mavi ışık yanıp sönene kadar. Sonra Onay seçeneğine dokunun ve bağlantı kurmak için enstrüman adını seçin. İlk örnek için go şerit tüplerinden kapakları çıkarın.

Her kuyuya 18 mikrolitre steril su ekleyin ve peleti çözmek için nazikçe pipet yapın. Her kuyuya iki mikrolitre örnek ekleyin ve tüpleri kauçuk test şerit kapaklarıyla kapatarak doğru konumu sağlayın. Tüm şeritler hazırlandıktan sonra başvuruda Onay tuşuna dokunun.

Her test şeridini çıkarın. Kuyunun dibinde kabarcık olup olmadığını kontrol edin, sonra şeridi hafifçe sallayın, ta ki kabarcıklar yükselene kadar. Devam etmek için Onay tuşuna dokunun.

Cihaz kapağını açın ve test şeritlerini doğru sırayla ve yönde alete yerleştirin. Kapağı kapatıp kilitlenene kadar ve Onayla. Koşuya başlamak için uygulamada Çalıştır düğmesine dokunun.

Çalışma bittiğinde, E-posta Sonuçları'na dokunun. Kablosuz internete bağlandıktan sonra, sonuçları iletmek için Tekrar Gönder tuşuna dokunun. Kontaminasyonu önlemek için tepsiyi denemeler arasında iyice temizleyin.

Biyolojik ekstraksiyon alanı kiti kullanılarak DNA izolasyonunun başarılı tamamlanması, doğrulanmış laboratuvar tabanlı yöntemle karşılaştırıldığında tutarlı qPCR sonuçlarıyla doğrulandı. Saha tabanlı qPCR birimi kullanılarak analiz edilen standart kültür seyreltme, hem 21 derece hem de 30 derece Celsius sıcaklıkta 10 tekrarda düşük sapma göstermiştir. Saha aletlerinin hassas testleri, tüm çalışmalarda göreceli standart sapmanın %5'in altında olduğunu gösterdi.

Bu yüzden bulgularımız, bu uzak bölgelerde çevresel izlemenin yapılmasını sağlayarak alanı gerçekten ilerletiyor ve erişilebilirliği, topluluk katılımını teşvik ediyor ve çok etkili bilimsel araştırmalar yapıyor. Sonuçlarımız, gönderiler sırasında örneklerin nasıl değiştiğini ve hemen çıkarma ve analiz sırasında nasıl değiştiğini anlamamıza yol açtı. Gelecekteki araştırmalar, tuzlu su gibi aşırı örnekler ve aşırı hava koşulları için bu yöntemlerin sınırlarını tanımlamaya odaklanacaktır.