Farelerin Kas ve Terminal Schwann Hücrelerinde Mitokondriyal Morfolojinin Yerinde Niceletilmesi Yöntemleri

Araştırmamız, nöromüsküler birleşimdeki terminal Schwann hücrelerinin mitokondriyal morfolojisini ilk kez araştırmaktadır. Yaklaşımımız, kapiller ve lenfatik yataklar gibi elde edilmesi zor olan dokularda mitokondriyal morfolojinin nicelendirilmesini sağlar. Başlamak için bir wild type ve bir D2-mdx fare edinin.

Anestezik derinliği parmak sıkıştırma refleksiyle doğrulandıktan sonra, iğneyi sağ diz tarafındaki distal tendona yerleştirin. İğneyi enjeksiyon yolu boyunca çekerken tibialis iç kasına 50 mikrolitre iki mikromolar uzak kırmızı floresan mitokondriyal leke enjekte edin ve boyayı in vivo bir saat kuluçka edin. Hayvanı anestezi altında tutarken, ötenazi öncesi TA kasını disseksiye ve izole etmek için makas ve pens kullanın.

İzole TA kasını oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit içine yerleştirin. Sonra, stereo mikroskop altında, lifleri nazikçe ayırdın. Hücre permisyona göre nükleik asit boyaması %4 paraformaldehite eklenir; böylece nükleer etiketleme için mililitrede beş ila 10 mikrogram nihai konsantrasyon elde edilir.

Sonra, TA kasını PBS'de üç kez, her biri beş dakika boyunca yıkayıp fazla boya giderin. Kası sıralı olarak %50, %75 ve %100 etanol ile beş dakika boyunca kurutun. Sonra, örneği doku temizleme çözümleri birer ve iki aralıkta 30 dakika boyunca sıralı olarak kuluçka altına alın, böylece tamamen suya batırıldığından emin olun.

Kası bir coverslip'e yerleştirin. Nazikçe düzleştirmek için 7,8 gram ağırlığında 2,5x2x1 santimetre ölçülerinde bir cam blok kullanın. Bir S100 beta faresi edinin.

Anestezik derinliği parmak sıkıştırma refleksi ile doğrulandıktan sonra, gluteus maximus yani GM kasının üzerinde küçük bir deri kesisi yapın. GM kasının altına 75 mikrolitre iki mikromolar uzak kırmızı floresan mitokondriyal leke enjekte edin. Yarayı kapatın ve boyanın 45 dakika kuluçka olmasına izin verin, böylece terminal Schwann hücreleri seçici olarak etiketlensin.

Hayvanı anestezi altında tutarken, GM kasını 10 dakika içinde disseksiye edin ve hemen soğutulmuş %0,9 steril salin içine yerleştirin. Sadece D2-mdx fareleri kullanılıyorsa, mikrodiseksiyon banyosuna floresan asetilkolin reseptör boyasını bir-500 seyreltme ile ekleyin ve dokuyu 30 dakika kuluçka edin. Fazla yağ ve bağ dokusunu kesin ve GM kasını, ventral tarafı aşağıya bakacak şekilde bir coverslip'e aktararak ters mikroskopi yapın.

GM'nin dorsal yüzeyine iki mikrolitre genel montaj ortamı ekleyin ve görüntülemeden önce dokuyu cam blokla düzleştirin. Yazılımda, uyarılma dalga boyunu 646 nanometreye ayarlayın. İki damla temizleme çözümü ikiye ekledikten sonra, TA kasını görüntülemek için 63X objektif lensi seçin ve Z yığını derinliğini yaklaşık 100 mikrometreye ayarlayın.

Sonra, dekonvolüsyon modunu seçin ve sistem optimize edilmiş parametreleri uygulayın. Adım boyutunu bir mikrometreye ayarlayın ve görüntüler alın. Terminal Schwann hücrelerinin görüntülerini elde etmek için 20 kat büyütme objektif lensi seçin, Z yığını derinliğini yaklaşık 17 mikrometreye ayarlayın ve görüntüler alın.

Sonra, 63 kat büyütme objektif lensini seçin ve bireysel terminal Schwann hücrelerinin görüntülerini alın. Yazılımı mitokondriyal sinyalleri tanıması için tek tek Z dilimlerini içe aktarın. Ve yapay zeka odaklı yazılım kullanarak nicel analiz yap.

Araştırmacı incelemesi için görüntü maskeleri geliştirin. Algoritma optimizasyonunu takip ederek 3D görüntü yığınlarını ayrı optik bölümlere ayırın. Her 3D görüntüden her beşte bir Z dilimini seçin ve örnek başına ortalamayı hesaplayın.

Tüm örneklerde görüntüleme parametrelerini standartlaştırın ve mitokondriyal morfolojiyi nicelikle ölçebilirsiniz. Grup farklılıklarını ve korelasyonlarını değerlendirmek için immünohistokimya ve istatistiksel analiz yapmak. Mdx kaslarında mitokondriyal bağlantı, vahşi tip farelere kıyasla azalmıştır.

Mdx farelerinde daha fazla sayıda küçük mitokondriyal parça ve daha az sayıda büyük birbirine bağlı mitokondriyal ağ gözlemlenmiştir. Vahşi tip farelerde, terminal Schwann hücrelerindeki mitokondriler, bifurkasyonlara yakın birbirine bağlı halka yapıları sergilerdi. Buna karşılık, mdx farelerinde mitokondriler parçalanmış ve bifurkasyonlara yakın halka oluşumları yokmuş gibi görünüyordu.

Konfokal ve elektron mikroskopisi, terminal Schwann hücrelerinde benzer donut şeklinde mitokondriyal yapıları doğrulamıştır. Postsinaptik analiz, asetilkolin reseptörleri etrafında kümelenmiş sub-sarkolemmal mitokondrilerin karakteristik pretzel benzeri yapıdan yoksundu. Görüntü analizi, MDX kasındaki terminal Schwann hücre mitokondrilerinin, vahşi tip kaslara kıyasla artan alan ve parçalanma gösterdiğini, göreli parçacık boyutunda bir fark olmadığını ortaya koydu.

Kas kuvveti ölçümleri, daha fazla değişkenlikle azalan seğirme ve MDX kasındaki zirve kuvvetin azaldığını gösterdi. Artan uyarılma frekanslarında kuvvet üretimi de MDX kaslarında önemli ölçüde azaldı. MDX kasında lif boyutunda sola doğru bir kayma vardı; bu da yabani tipe kıyasla yaklaşık %60 daha küçük miyofiberleri gösteriyordu.

Bu protokol, araştırmacıların iskelet kasları ve terminal Schwann hücrelerinde mitokondriyal morfolojiyi incelemelerine ve niceliklerini belirlemelerine olanak tanır. Gelecekteki çalışmalar, mikro sirkülasyon ve lenfatik damarlarda mitokondriyal morfolojiyi incelemek için bu yaklaşımı uyarlayabilir.