Farelerin Kas ve Terminal Schwann Hücrelerinde Mitokondriyal Morfolojinin Yerinde Niceletilmesi Yöntemleri
10 Nisan 2026
Mitokondriyal boya terminali olan Schwann hücre mitokondrilerinin in vivo konfokal mikroskopi için yerel enjeksiyonları. Bu yöntem, sağlıklı veya hasta kaslı farelerin iskelet kas dokularında gösterilen kavram kanıtını kullanarak yüksek çözünürlüklü mitokondriyal görselleştirme sağlar.
Araştırmamız, nöromüsküler birleşimdeki terminal Schwann hücrelerinin mitokondriyal morfolojisini ilk kez araştırmaktadır. Yaklaşımımız, kapiller ve lenfatik yataklar gibi elde edilmesi zor olan dokularda mitokondriyal morfolojinin nicelendirilmesini sağlar. Başlamak için bir wild type ve bir D2-mdx fare edinin.
Anestezik derinliği parmak sıkıştırma refleksiyle doğrulandıktan sonra, iğneyi sağ diz tarafındaki distal tendona yerleştirin. İğneyi enjeksiyon yolu boyunca çekerken tibialis iç kasına 50 mikrolitre iki mikromolar uzak kırmızı floresan mitokondriyal leke enjekte edin ve boyayı in vivo bir saat kuluçka edin. Hayvanı anestezi altında tutarken, ötenazi öncesi TA kasını disseksiye ve izole etmek için makas ve pens kullanın.
İzole TA kasını oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit içine yerleştirin. Sonra, stereo mikroskop altında, lifleri nazikçe ayırdın. Hücre permisyona göre nükleik asit boyaması %4 paraformaldehite eklenir; böylece nükleer etiketleme için mililitrede beş ila 10 mikrogram nihai konsantrasyon elde edilir.
Sonra, TA kasını PBS'de üç kez, her biri beş dakika boyunca yıkayıp fazla boya giderin. Kası sıralı olarak %50, %75 ve %100 etanol ile beş dakika boyunca kurutun. Sonra, örneği doku temizleme çözümleri birer ve iki aralıkta 30 dakika boyunca sıralı olarak kuluçka altına alın, böylece tamamen suya batırıldığından emin olun.
Kası bir coverslip'e yerleştirin. Nazikçe düzleştirmek için 7,8 gram ağırlığında 2,5x2x1 santimetre ölçülerinde bir cam blok kullanın. Bir S100 beta faresi edinin.
Anestezik derinliği parmak sıkıştırma refleksi ile doğrulandıktan sonra, gluteus maximus yani GM kasının üzerinde küçük bir deri kesisi yapın. GM kasının altına 75 mikrolitre iki mikromolar uzak kırmızı floresan mitokondriyal leke enjekte edin. Yarayı kapatın ve boyanın 45 dakika kuluçka olmasına izin verin, böylece terminal Schwann hücreleri seçici olarak etiketlensin.
Hayvanı anestezi altında tutarken, GM kasını 10 dakika içinde disseksiye edin ve hemen soğutulmuş %0,9 steril salin içine yerleştirin. Sadece D2-mdx fareleri kullanılıyorsa, mikrodiseksiyon banyosuna floresan asetilkolin reseptör boyasını bir-500 seyreltme ile ekleyin ve dokuyu 30 dakika kuluçka edin. Fazla yağ ve bağ dokusunu kesin ve GM kasını, ventral tarafı aşağıya bakacak şekilde bir coverslip'e aktararak ters mikroskopi yapın.
GM'nin dorsal yüzeyine iki mikrolitre genel montaj ortamı ekleyin ve görüntülemeden önce dokuyu cam blokla düzleştirin. Yazılımda, uyarılma dalga boyunu 646 nanometreye ayarlayın. İki damla temizleme çözümü ikiye ekledikten sonra, TA kasını görüntülemek için 63X objektif lensi seçin ve Z yığını derinliğini yaklaşık 100 mikrometreye ayarlayın.
Sonra, dekonvolüsyon modunu seçin ve sistem optimize edilmiş parametreleri uygulayın. Adım boyutunu bir mikrometreye ayarlayın ve görüntüler alın. Terminal Schwann hücrelerinin görüntülerini elde etmek için 20 kat büyütme objektif lensi seçin, Z yığını derinliğini yaklaşık 17 mikrometreye ayarlayın ve görüntüler alın.
Sonra, 63 kat büyütme objektif lensini seçin ve bireysel terminal Schwann hücrelerinin görüntülerini alın. Yazılımı mitokondriyal sinyalleri tanıması için tek tek Z dilimlerini içe aktarın. Ve yapay zeka odaklı yazılım kullanarak nicel analiz yap.
Araştırmacı incelemesi için görüntü maskeleri geliştirin. Algoritma optimizasyonunu takip ederek 3D görüntü yığınlarını ayrı optik bölümlere ayırın. Her 3D görüntüden her beşte bir Z dilimini seçin ve örnek başına ortalamayı hesaplayın.
Tüm örneklerde görüntüleme parametrelerini standartlaştırın ve mitokondriyal morfolojiyi nicelikle ölçebilirsiniz. Grup farklılıklarını ve korelasyonlarını değerlendirmek için immünohistokimya ve istatistiksel analiz yapmak. Mdx kaslarında mitokondriyal bağlantı, vahşi tip farelere kıyasla azalmıştır.
Mdx farelerinde daha fazla sayıda küçük mitokondriyal parça ve daha az sayıda büyük birbirine bağlı mitokondriyal ağ gözlemlenmiştir. Vahşi tip farelerde, terminal Schwann hücrelerindeki mitokondriler, bifurkasyonlara yakın birbirine bağlı halka yapıları sergilerdi. Buna karşılık, mdx farelerinde mitokondriler parçalanmış ve bifurkasyonlara yakın halka oluşumları yokmuş gibi görünüyordu.
Konfokal ve elektron mikroskopisi, terminal Schwann hücrelerinde benzer donut şeklinde mitokondriyal yapıları doğrulamıştır. Postsinaptik analiz, asetilkolin reseptörleri etrafında kümelenmiş sub-sarkolemmal mitokondrilerin karakteristik pretzel benzeri yapıdan yoksundu. Görüntü analizi, MDX kasındaki terminal Schwann hücre mitokondrilerinin, vahşi tip kaslara kıyasla artan alan ve parçalanma gösterdiğini, göreli parçacık boyutunda bir fark olmadığını ortaya koydu.
Kas kuvveti ölçümleri, daha fazla değişkenlikle azalan seğirme ve MDX kasındaki zirve kuvvetin azaldığını gösterdi. Artan uyarılma frekanslarında kuvvet üretimi de MDX kaslarında önemli ölçüde azaldı. MDX kasında lif boyutunda sola doğru bir kayma vardı; bu da yabani tipe kıyasla yaklaşık %60 daha küçük miyofiberleri gösteriyordu.
Bu protokol, araştırmacıların iskelet kasları ve terminal Schwann hücrelerinde mitokondriyal morfolojiyi incelemelerine ve niceliklerini belirlemelerine olanak tanır. Gelecekteki çalışmalar, mikro sirkülasyon ve lenfatik damarlarda mitokondriyal morfolojiyi incelemek için bu yaklaşımı uyarlayabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Overview
This protocol presents a reproducible method for labeling and quantifying three-dimensional mitochondrial network morphology in whole-mount skeletal muscle and terminal Schwann cells (tSCs) in mice. Utilizing in vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye and standard confocal microscopy, the approach enables detailed analysis of mitochondrial architecture within intact neuromuscular tissues, overcoming challenges associated with tissue disruption and anatomical complexity.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular neuroscience
- Muscle biology
- Imaging and microscopy
Background
- Mitochondrial network morphology is a key indicator of cellular health.
- Quantifying mitochondrial architecture in intact tissues is technically challenging.
- Terminal Schwann cells (tSCs) are critical for neuromuscular junction maintenance and regeneration.
- tSCs are difficult to analyze in situ due to their location and sensitivity to tissue disruption.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for labeling and quantifying mitochondrial morphology in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- To enable analysis of mitochondrial networks in situ without the need for transgenic reporters or specialized imaging platforms.
- To validate the method in both healthy and dystrophic muscle tissue.
Methods Used
- In vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye.
- Rapid tissue processing to preserve mitochondrial structure.
- High-resolution confocal microscopy for three-dimensional imaging.
- Image stack analysis to quantify mitochondrial network connectivity, area, and fragmentation.
Main Results
- The protocol successfully labels and quantifies mitochondrial networks in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- Validation in dystrophic and healthy muscle confirms expected differences in mitochondrial morphology.
- The method is adaptable to tSCs using S100β reporter mice.
- Analysis can be performed using equipment commonly available in university core facilities.
Conclusions
- This approach enables detailed analysis of mitochondrial morphology in intact neuromuscular tissues.
- It eliminates the need for transgenic mitochondrial reporters or specialized imaging platforms.
- The protocol is adaptable to other thin or superficially accessible tissues.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ analysis of mitochondrial morphology in muscle and terminal Schwann cells addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuromuscular and metabolic disease research. This protocol enables high-content, reproducible assessment of mitochondrial network integrity within intact tissues, supporting predictive confidence in disease-relevant models and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its compatibility with standard imaging infrastructure enhances accessibility and scalability across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial network health in physiologically relevant tissue environments.
- Supports functional target validation by quantifying network connectivity, area, and fragmentation in disease and control models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing mitochondrial phenotypes in healthy versus dystrophic muscle.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and quantification workflows for mitochondrial morphology in whole-mount tissues.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of interventions affecting mitochondrial dynamics in accessible tissue systems.
- Supports platform reuse across multiple tissue types without reliance on transgenic reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology endpoints with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in both muscle and Schwann cells.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of mitochondrial-targeted therapeutics.
- Facilitates adaptation to additional thin or superficially accessible tissues for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial morphology quantification in intact tissues, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking through direct measurement of mitochondrial network features.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers network connectivity, area, and fragmentation metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow compatible with standard confocal microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Promotes reproducibility and scalability using widely available imaging infrastructure.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted programs across disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Utilizes standard membrane potential–sensitive dyes and imaging platforms common to core facilities.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other thin or superficially accessible tissues with minimal protocol modification.
- Dependent on tissue accessibility and dye compatibility for optimal results.
