Korunmuş fonksiyon ve mimariyle ex vivo insan sinovyal dokusu kullanılarak sinovitin klinik öncesi modeli

Cevaplamak istediğimiz ana sorular, bulaşıcı ve enflamatuar uyaranlara yönelik özgün sinovyal bağışıklık tepkisi nedir ve bunun sinovyal yapıdaki değişikliklere nasıl yansıdığıdır. Ana klinik ve araştırma odak noktam, ilerlemiş RC artriti olan morbid obez hastaların tedavisidir. Bu hasta popülasyonunda, hastalıkları için cerrahi tedavi seçenekleri bulmakta zorlandıkları için tıbbi olarak ihmal edilmişlerdir.

Başlamak için ameliyathanede artrotomi ve diseksiyon gerçekleştirin. Standart medial parapatellar yaklaşımı kullanın ve morbid obezite ve ilerlemiş osteoartrit olan bir hastada ameliyat yaparken daha geniş bir eksipozisyon gerçekleştirin. Ön sinovyumu tanımlayın ve dokuyu çıkarmak için elektrokauteri kullanın.

Enflamasyon belirtileri için diz eklemini gözlemleyin, çünkü obeziteli hastalarda lokal bir enflamatuar yanıt sergileyebilirler ve bu, obezitenin daha geniş enflamatuar etkileriyle ilişkili olabilir. Sinovyumu steril bir şekilde araştırma ekibi üyesine ulaşırın. Soğuk Dulbecco's PBS veya DPBS ile dolu olan numune kabını buz üzerine yerleştirin ve toplam diz artroplastisi sırasında elde edilen insan ön sinovyal dokusunu kabın içine aktarın.

Dokusunu soğuk DPBS'de bir plaka rocker üzerinde 10 dakika süreyle iki kez yıkayın. Ardından sinovyumu, Biosafety Level 2 kabini altında 10 santimetre veya daha büyük bir steril Petri kabına aktarın. Yarım dolu olana kadar, sodyum pirüvat ve L-glutamin içeren soğuk steril düşük glukozlu DMEM ekleyin.

İncimsi intimal tabaka ile sinovyal çizgiyi, onu soymadan tanımlayın. En az iki teknik tekrar için üç milimetre biyopsi çekirdeği elde etmek için gereken aletleri düzenleyin. İris makasları veya bir neşter kullanarak, yakılmış taraftan fazla yağ ve stroma dokusunu çıkararak sinovyumu izole edin, tüm boyunca yaklaşık dört ila beş milimetre doku derinliğini koruyun.

Gerekirse alanın görüşünü korumak için Petri kabının ortamını değiştirin. Dokuyu, sinovyal çizgi koruyucu aletin karşısında olacak şekilde yerleştirin. Dokuyu, forseps veya hemostat kullanarak baskın olmayan elinizle sabitleyin ve hafifçe çevirerek sıkı bir dikey basınç uygulayarak dokudan çekirdek alın.

Biyopsi delicisini yaklaşık 10 ila 15 kullanımdan sonra veya dokunun delme sırasında büküldüğünde değiştirin, böylece intimal çizgi yapısına zarar vermeyin. İkinci bir Petri kabını açın ve 37 derecede temperlenmiş olan %10FBS içeren beş ila on mililitre ortamla doldurun. Düz veya dişsiz forseps kullanarak çekirdekleri kabın içine aktarın ve bir ila iki saniye boyunca hafifçe çalkalayın, böylece molozları sıkmadan yıkayın.

Eklem Boşluğu Analiz Sisteminin alt kuyuğunu hazırlamak için 37 derecede temperlenmiş olan 10%FBS içeren düşük glukozlu DMEM'in 600 mikrolitresini ekleyin. Alt kuyuğa araç kontrolünü veya tercih edilen tedavi reaktifini, örneğin LPS veya MCP-1'i ekleyin. İstenen deney sonucuna göre transwell gözenek boyutunu seçin ve transwell'e 10%FBS içeren düşük glukozlu DMEM'in 300 mikrolitresini ekleyin.

Steril forseps kullanarak bireysel doku çekirdeklerini, yırtık ve yüzen çekirdeklerden kaçınarak, transwell'in ortamına nazikçe aktarın. Ardından, montajı sekiz ila 72 saat boyunca 37 derecede %5 karbon dioksit ile bir inkübatöre yerleştirin, gerçekleştirilecek olan aşağı akış analizlarına göre değişir. Sinovyal dokuyu %10 nötral tamponlu formalinde sabitleyin.

Sonra histolojik analiz için gömme yapın ve kesin. Hematoksilin ve eosin ile boyamadan sonra, doku kesitlerini 10X ve 40X'te parlak alan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. 40X TIFF görüntüsünde intimal çizgi ve sublining bölgelerini Photoshop kullanarak çizerek, hedef dışı alanları, eritrositleri ve büyük damarları maskeleyin, sonraki kantitatif analiz için.

Son maskeleri analiz edin ve intimal çizgi ve sublining kalınlığını, bütünlüğünü ve hücreselliğini niceliklendirin. Son olarak, geçiş yapan hücreleri akış sitometrisi ile ve toplanan ortamdaki çözünür faktörleri enzim bağlı immünosorbent analizi ile değerlendirin. Artan dozlarda MCP-1 veya LPS ile kültürlenen sinovyal doku, kontrole kıyasla değişken intimal çizgi morfolojisi değişiklikleri gösterdi, bu değişiklikler arasında gevrek intimal çizgi ve azalmış hücre yoğunluğu ile kalınlaşmış intimal çizgi bulunmaktadır.

MCP-1 ve LPS tedavisi sinovyal sitokin tepkisini değiştirdi. MCP-1, sublining'de patojenik fibroblast markörü podoplanin ekspresyonunu indüklediği halde, LPS hem intimal çizgide hem de sublining'de podoplaninin artmasını sağladı. Alt kuyuğa geçen bağışıklık hücreleri arasında nötrofiller, NK hücreleri, NKT hücreleri, T hücreleri, B hücreleri veya dendritik hücreler, monositler veya makrofajlarla birlikte M2 makrofajlarla birlikte yer almaktadır.

T hücreleri en bol bulunan geçiş yapan bağışıklık hücreleriydi. İstatistiksel olarak, alt kuyuğun uyarıcına göre hücre göçünde fark yoktu. Artritle ilgili bir protein olan osteoprotegerin, 24, 48 ve