Phytophthora palmivora'nın Agrobakteri Aracılı Dönüşümü İçin Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Bu protokol, phytophthora palmivora ve phytophthora capsici'yi dönüştürmek için basit, etkili ve tekrarlanabilir bir sistem sunar. Başlamak için, antibiyotiklerle takviye edilmiş yeni bir LB burgu plakası alın. Plakanın ortasına 20 mikrolitre LB sıvı ortam ekleyin ve steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü ile daha önce yetiştirilmiş bir plakadan agrobakteriyel hücreleri alın.

Tüpün alt ve düz tabanını kullanarak hücreleri plaka boyunca eşit şekilde yayın. Plakayı gece boyunca 28 derece Celsius'ta yaklaşık 16 ila 18 saat kuluçka altına alın. Sonra, bir mililitrelik pipet ucu ile gecede yetiştirilen agrobakteriya hücrelerini al.

Hücreleri bir mililitre agrobakteriyel indüksiyon ortamında yukarı ve aşağı pipetle yeniden askıya alın. Şimdi, yeniden askıya edilmiş hücreleri folyo ile kaplanmış steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve agrobakteriyel indüksiyon ortamı ekleyin. Numunenin optik yoğunluğunu 600 nanometrede ölçüp agrobakteriyel indüksiyon ortamıyla seyreltirerek 0,4 optik yoğunluk elde edilir.

Sonra bakteriyel süspansiyonu içeren folyo kaplı tüpün kapağını gevşet. Yaklaşık dakikada 70 devirde hafif bir çalkalama ile platform sarstısına yerleştirin. Yedi ila sekiz günlük phytophthora palmivora levhasını dört derece Celsius'a kadar önceden soğutmuş 10 mililitre su ile doldurun.

Yüzeye hafifçe dokunmak için pipet ucu kullanın ve ortamdaki hava kabarcıklarını çıkarın. Tabağı dört derece Celsius'ta 15 dakika kuluçka yapın. Sonra ışık altında oda sıcaklığında 15 dakika daha geçirin.

Bir pipet kullanarak, yaklaşık yedi ila sekiz mililitre serbest bırakılan zoosporları steril 15 mililitrelik santrifüj tüpüne nazikçe aktarın, miselyum ve sporanjileri rahatsız etmeden. Daha sonra zoosporun süspansiyonundan 20 mikrolitre 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve süspansiyonu on kat seyreltmek için 180 mikrolitre su ekleyin. Zoosporları ısrarla belirtmek için tüpü bir dakika girdabla kontrol edin ve mikroskop altında hemositometre kullanarak zoosporları sayın.

Hazırlanmış agrobakteriyel süspansiyondan beş mililitre, steril 50 mililitrelik folyo kaplı bir tüpte zoosporun süspansiyonuna beş mililitre ekleyin. İçindekileri nazikçe karıştırın, tüpün kapağını gevşetin ve iki saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. İnkubasyon sırasında AZCA plakalarını hazırlayın.

Ortam katılaştığında, bir parça sterilize edilmiş Hybond-N+membranı plakaya yerleştirin ve plakayı karanlıkta tutun. İki saatlik ko-kuluçkadan sonra, pipet ucu kullanarak karışımın 300 mikrolitresini Hybond-N+membran üzerine yayarak kenarların sıvıdan arınmasını sağlar. Petri kaplarını kapta yaklaşık 10 dakika açık bırakın ki karışım havada kurusun.

Sıvı membran üzerinde hareket etmeyi bıraktığında, plakaları kapatın. Örtülü plakaları 25 derece Celsius sıcaklığında iki gün boyunca kuluçka yapın. 48 saatlik kuluçkadan sonra, sterilize edilmiş forsepsle Hybond-N+membranı Plich burgu plakasına ters olarak vinge yüzeyi boyunca sürüklenmeden aktarın.

1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün düz tabanını kullanarak membran yüzeyi boyunca nazikçe bastırıp kaydırarak ortamla tam temas sağlanır. Plakanın alt kısmında hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin ve aynı düz tabanla nazikçe bastırın. Plakayı 25 derece Celsius sıcaklığında, 12 saatlik ışık ve 12 saatlik karanlık döngü altında iki ila üç gün boyunca kuluçka edin.

Son olarak, iki ila üç günlük kuluçkadan sonra, steril forseps ile zarı çıkarın ve plakayı aynı ışık ve sıcaklık koşullarında kuluçkaya devam ettirin. Phytophthora palmivora zoosporlarının agrobacterium tumefaciens EHA 105 ile pCB301TOR-GFP eksprese edilmesi, Plich burgusunda 30 mikrogram/mililitre G418 takviyesi ile desteklenen G418 dirençli koloniler ortaya çıkardı; oysa kontrol plakalarında agrobakteriyel enfeksiyon olmadan koloni bulunmamıştır. Güçte yedi zoosporda 10 kişide G418 dirençli dönüştürücü sayısı birinci deneyde 55, ikinci deneyde ise 50 idi.

Floresan mikroskopi, phytophthora palmivora dönüştürücülerinde net yeşil floresan protein sinyalini doğruladı. Ayrıca, bu protokol phytophthora capsici'ye uygulanarak GFP ifade eden transformantları başarıyla üretmiştir. Protokolümüz, araştırmacıların gen fonksiyonlarını incelemesini, protein hücresel lokalizasyonunu belirlemesini ve patojen enfeksiyon dinamiklerini takip etmesini sağlar.

Bu protokoller düşük oranda yanlış pozitif üretebilir ve bu nedenle gerçek dönüştürücüleri doğrulamak için ek yaklaşımlar gerektirir. Bu dönüşüm sisteminin uygulanması diğer oomycete ve mantarlara da genişletilebilir. Gelecekte bu protokolü daha da basitleştirmeye çalışacağız.