In Vitro Hücresel Esneme ve Görüntüleme İçin Yeni Bir Platform

Amacımız, mekanik esnemenin hücre fonksiyonunu nasıl etkilediğini araştırmak için düşük maliyetli Hoberman esinli mikroskop uyumlu hücre esneme cihazı geliştirmekti. Bu cihaz, araştırmacıların mekanik uyarılara karşı yaşam hücrelerinin yanıtlarını incelemelerine olanak tanır; bu tepkiler atan kalp veya nefes alan akciğerler gibi fizyolojik sistemleri taklit eder. Uygun yere kişisel koruyucu ekipman ile başlayalım.

Silgard 184 bazını ve kürleme maddesini plastik bir kabda 10'a bir oranında karıştırın. Dil bastırıcı ile bileşenleri iki ila üç dakika boyunca kuvvetli karıştırın. Sonra kabı bir saat boyunca gazlaştırma odasına koyun.

Sonra, hazırlanmış 3D baskılı kalıpları alın ve izotropik kalıba 1,3 gram PDMS karışımı ekleyin. Sonra tek eksenli kalıba 0,5 gram PDMS karışımı ekleyin. Jeli kalıp üzerine eşit şekilde yayın ve doldurulmuş kalıbı bir saat boyunca gazdan çıkarın.

Kalıptaki jelin oda sıcaklığında düz bir yüzeyde iki saat boyunca birikmesine izin verin. Sonra küfü gece boyunca 60 derece sıcaklıkta fırında kürleyin. Sonra, NuSil jel 8100'ün A ve B parçalarını eşit oranlarda karıştırın.

Kombine jeli silgard 184 çapraz bağlayıcı ile toplam hacmin %0,36'sında karıştırarak 13 kilopaskal substrat sertliği elde edin. 0.3 kilopaskal sertlikte yumuşak bir alt tabaka oluşturmak için, çapraz bağlayıcıyı eklemeyi atlayın, ardından çözeltiyi 15 dakika boyunca karıştırın. NuSil karışımını gazdan çıkarma kamerasına yerleştirin ve 30 dakika boyunca gazı yapın.

Şimdi PDMS jelini özel kalıptan dikkatlice çıkarın ve 40 milimetrelik bir kapak parçasına yırtmadan yerleştirin. Sonra PDMS jelini spin kodlayıcıya yerleştirin. NuSil karışımından 100 mikrolitre pipotle izotropik PDMS jelinin negatif alanına pipetleyin.

Sonra 50 mikrolitre NuSil karışımını unial eksenel PDMS jelinin negatif alanına pipetleyin. Sonra 50 saniye boyunca yedi G'de kod aldım. 100 mikrometre kalınlığa ulaşmak için.

Kaplanmış jelin oda sıcaklığında düz bir yüzeyde iki saat boyunca birikmesine izin verin. Jeli fırına koyup gece boyunca 60 derece Celsius'ta kürleyin. Şimdi insan hava yolu, pürüzsüz kas hücreleri elastik hücre kültüründe tohumlanıp standart koşullarda kuluçka içinde.

Daha sonra hücreleri görüntüleme için FLIPR Kalsiyum altı çözeltisi ile karıştırın. Çekiş kuvveti ölçümü için, PDMS NuSil jel substratlarını floresan boncuklar tabakasıyla kaplayarak fiducial işaretleyici olarak kullanılacaktır. HBSS'de bir mikrometre çapında kırmızı floresan karboksilat modifiye mikrosferlerden oluşan %0,025 bir çözelti hazırlayın.

Vortex mikser ile boncuk çözeltisini 10 saniye boyunca soyut. Sonra boncuk çözeltisinden 880 mikrolitre izotropik jele pipetleyin. Tek eksenel jele 420 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin.

Jeli oda sıcaklığında bir saat kuluçka altına aldıktan sonra, boncuk dağılımını korumak için boncuk çözeltisini dikkatlice çıkarın. Sonra pamuklu çubuk veya laboratuvar mendiliyle jel yüzeyindeki kalıntı çözeltiyi nazikçe temizleyin. Sonra, kamera, ışık motoru ve 10 x kuru objektif ile donatılmış ters bir mikroskop kullanın.

Uyarımayı 475 x 40 nanometreye ve emisyonu 555 x 50 nanometreye ayarlayın. Stretch deneylerinde iki hertz kare hızında 16 bit görüntüler elde edin. Şimdi izotropik jel sedyeye üzerine yerleştirin ve ardından floresan boncukları 10 x kuru objektif ile donatılmış ters mikroskopla görüntüleyin; esneme öncesi durumda görüntü yakalıyorsunuz.

Alt tabanın merkezindeki germe protokolü boyunca sürekli görüntü alın. Gerekirse görüntü çekmeden önce mikroskobu gerilmiş pozisyonda yeniden odaklayın. Görüntüleri, furier çekiş kuvveti mikroskobusuna dayalı özel MATLAB kodu kullanarak analiz ederek yer değiştirme vektörlerini ve ilgili düzlemsel gerilme alanlarını hesaplayın.

Verileri son denemelerin ortalaması olarak temsil edin. 240 mikrometrelik bir yer değiştirme uygulandığında, floresan boncuklar merkezden radyal olarak dışa doğru kaymaya neden oldu. Çekiş kuvveti mikroskopisi, merkezden dışa doğru yayılan ve mesafe arttıkça büyüklüğü artan vektörlerle izotropik bir yer değiştirme alanı ortaya koydu.

İzotropik yer değiştirme alanı, homojen bir düzlemsel gerilme alanı oluşturdu. Yer değiştirmenin 1000 mikrometreye yükselmesi, radyal yönelimi koruyarak büyüklüğü artan yer değiştirme vektörlerinin ortaya çıkmasına yol açtı. 1000 mikrometrede karşılık gelen gerilme alanı, radyal simetrik kalırken büyüklüğünü artırdı.

250 mikrometre yer değiştirmeye maruz kalan unial eksenli jellerde, yer değiştirme vektörleri ağırlıklı olarak tek eksen boyunca hizalanmıştı ve bu da bir eksenli gerilmeyle uyumlu oldu. Gerilme dalga formları, programlanmış motor yer değiştirmelerini yakından yansıtıyor ve üç tekrarlanan döngü boyunca senkronize kalıyordu. Maksimum yer değiştirmedeki sürün değerleri üç bağımsız örnekte tutarlı kaldı.

5.555 mikrometreye kadar geçici bir yer değiştirme uygulandığında, %0,1'den %12'ye kadar değişen suşlar oluştu. Geçici 0,5% suş, esneme sonrası daha yüksek floresans yoğunluğu olarak görülen hücre içi kalsiyumda artışa yol açtı. Nesyenimizi kullanarak araştırmacılar canlı hücre kalsiyum görüntülemesi, çekiş kuvveti mikroskobu yapabilir ve izotropik veya tek eksenel gerilmeye karşı hücresel mekanik yanıtları niceliklerini ölçebilirler. Kritik bir adım, jellerin düz bir yüzeyde sertleşmesini sağlamaktır; çünkü düzensiz kalınlık substratı odaktan çıkarabilir ve canlı görüntüleme sırasında optik netliği azaltabilir.

Gelecekteki çalışmalar, esneme kaynaklı sitoskelet yeniden yönlendirmelerini, astım veya akciğer hasarıyla ilgili patolojik strain durumlarını ve çeşitli hücre tiplerini inceleyebilir.