Digitonin-permeabilize BE(2)-C nöroblastom hücrelerinde oksidatif fosforilasyon bağlanmasının kolinergik ligand-bağımlı modülasyonu

Bu deneyin genel amacı, sağlam kültürlü nöroblastom hücrelerinde mitokondriyal biyoenerjiği seçmeli permeabilizasyon ve substrat inhibitörü kombinasyonu kullanarak değerlendirme yöntemini göstermektir. Geleneksel olarak, mitokondriyal solunum Oroboros O2K yüksek çözünürlüklü respirometre, Clark tipi oksijen elektrotu ve Seahorse XF analizörü gibi aletlerle değerlendirilir. Dokulardan veya hücrelerden izole veya zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyona dayanan geleneksel yöntemler genellikle mitokondriyal yapıyı tehlikeye atar.

Örneğin, fare korteksinden izole edilen bu mitokondri elektron mikroskobu görüntüsü, mitokondrilerin pre-sinaptik terminallerde kapsüllenmiş olup olmamasına bağlı olarak yapısal bütünlükte belirgin bir zıt ortaya koymaktadır. Pre-sinaptik terminallerde kapsüllenmiş kalan mitokondriler, bu resimdeki camgöbeği oklarıyla da anlaşıldığı gibi, yapısal olarak sağlam görünür. Buna karşılık, kapsüllenmemiş veya çevresindeki membran yapısı olmayan mitokondriler genellikle sarı oklarla temsil edildiği şekilde şekilsiz görünür.

Seahorse Flex analizörü, hem kültürlenmiş hücrelerde hem de izole mitokondrilerde mitokondriyal biyoenerjiği incelemek için yaygın olarak kullanılır. Kültürlü hücre tabanlı analizde, hücresel mimari ve sinyal ağları korunur. Ancak, sağlam hücrelerin plazma zarı birçok trikarboksilik asit döngüsü substratlarına karşı geçirimsizdir.

Bu, plazma zarı bariyeri olmayan ancak genellikle yapısal artefaktları sergileyen izole mitokondrilere kıyasla metabolik analiz kapsamını sınırlar. Bu nedenle, her iki sistemin de doğuştan gelen sınırlamaları vardır. Burada sunulan teknik, plazma zarının kolesterol açısından zengin olduğunu, mitokondriyal zarın ise çok az miktarda içerdiğini kullanır.

Digitonin gibi kolesterol bağlayıcı deterjan kullanarak, mitokondriyal zarı sağlam bırakırken plazma zarını seçici olarak geçirebiliriz. Bu yaklaşım, organel bütünlüğünden zarar görmeden mitokondriyal substratlar ve inhibitörlerin hücreye kontrollü girişini sağlar. Böylece, bu teknik, mitokondrilerin sağlam hücreler bağlamında fonksiyonel analizini mümkün kılarak, tüm hücre mimarisinin avantajını izole mitokondriyal testlerin erişilebilirliğiyle birleştirir.

Deneye, hücrelerinizin alt konfluent kültür kabı ile başlayın. Hücreleri steril fosfat tamponu ile nazikçe yıkayın Hücre monotabakasını eşit şekilde kaplamak için uygun hacimde Triton çözeltisi ekleyin. İnkubasyondan sonra kabı çıkarın ve hücrelerin yerinden çıkmasına yardımcı olmak için yatay olarak hafifçe vurun veya sallayın.

Beş ml pipet ve pipet kontrolörü kullanarak, hücre süspansiyonunu birkaç kez yukarı aşağı pipetleyin, böylece herhangi bir küme parçalanarak tek hücreli süspansiyon elde edilir. Hücre süspansiyonunu mikroskop altında inceleyerek tekli bir hücreli süspansiyon doğrulanın. Hücreleri hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile sayın.

Hücre konsantrasyonunu 100 mikrolitrede yaklaşık 10.000 hücre içerecek şekilde ayarlayın. Hücre süspansiyonundan 100 mikrolitreyi dikkatlice Seahorse XF test plakasının her kuyusuna hızlandırın. Test sırasında arka plan kontrolü olarak hizmet etmek için bir kuyuyu boş bırakın.

Plakayı, hücrelerin kuyunun dibine yapışmasını sağlamak için hücre kültüründe iki ila üç saat kuluçka yapın. Hücreler bağlandıktan sonra, her kuyuya nazikçe 300 mikrolitre test ortamı ekleyin. Plakayı kuluçka makinesine geri götürün ve hücrelerin stabil olup büyümesi için gece boyunca kuluçka yapın.

Hücrelerin her kuyunun dibinde eşit bir monokatman oluşturduğundan emin olun. Aşırı kalabalıktan kaçının. Hücreler birleşik olmalı, ancak aşırı karışmamalı, böylece optimal test performansı sağlanabilir.

Deneyden bir gece, XFp 24 sensör kartuşunu her kuyuya bir ml kalibrasyon tamponu ekleyerek nemlendirin. Alternatif olarak, pH 7.4 olan fosfat tampon tuzlu sonu kullanabilirsiniz. Kartuşu yatakta gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.

Kartuş yükleme sürecinde oda sıcaklığında dengelendiğinden, COT olmayan bir kuluçka makinesinde 37 derece derecede kuluçka yapılması gerekmez. Tüm donmuş stok çözeltilerini ve oda sıcaklığında 2x mikroglial test tamponu çağırın. pH kontrol et, 7.4 olmalı.

Gerekirse ayarlama yap. Tüm substrat ve enjeksiyon çözeltilerini hazırlayın ve pH tekrar kontrol edin. Tüm çözeltileri buzun üzerinde kullanana kadar sakla.

A, B, C ve D etiketli besin tüplerini sensör kartuş enjeksiyon portu çözeltileri için hazırlayın. Her port için ilgili inhibitörler veya substratlar içeren çözümler yapmak en iyisidir. Çok kanallı pipet kullanarak, her enjeksiyon portu çözeltisinden 50 mikrolitre, ilgili portlara, A'dan D'ye dikkatlice yükleyin.

Deneyden bir ila iki saat önce Seahorse biyoanalizörünü başlatın, böylece iç kuluçka makinesi 37 derece derecede stabil hale getirebilir. Her bir kuyuyu etiketleyin ve deneysel tasarımınıza ve Wave Desktop 2.6 yönergelerine göre gruplayın. Biyoanalizörü uygun karışım, ağırlık ve ölçüm döngüsü için programlayın.

Referans için tablo 8'e bakınız. Ölçüm döngüsünün başında dengeleme seçeneğinin devre dışı bırakılması önemlidir. Takmak deneyi gereksiz yere uzatır ve alt tabanları tüketebilir.

Başlatma Makine önce sensör kartuşunu kalibre eder, bu yaklaşık 15 dakika sürer. Sensör kartuşunu kalibrasyona geçirdikten hemen sonra hücre plakasını hazırlamaya başlayın. Hücreleri rahatsız etmeden yaklaşık 700 mikrolitre mitokondriyal test tamponu ile her bir yuvaya dikkatlice aspire edin ve plakanın dengelenmesi için bir dakika bekletin.

Her kuyidan tamponu dikkatlice aspire edin, yapışan hücreleri rahatsız etmeden. Tam ortam için yıkama makinesi adımını üç kez tekrarlayın. Paralel olarak, hücresiz bir arka plan kuyusuna 50 mikrolitre mitokondriyal test tamponu ekleyin.

Menisküsü hacim tutarlılığı için görsel referans olarak kullanın. Hücre içeren kuyulardan tamponu dikkatlice aspire edin, hücre hidratını korumak için yaklaşık 50 mikrolitre bırakın. Plakayı 37 derece sıcaklıkta, ya su yüzeyinin üzerinde tutarak su banyosunda ya da buharlaşmayı önlemek için herhangi bir doygun atmosferde çelik olmayan bir kuluçka makinesinde.

Analizöre yüklenmeden hemen önce, her kuyuya 450 mikrolitre önceden ısıtılmış mitokondriyal test tamponu ekleyin; bu tampon ihtiyaç duyulduğunda analiz substratları, inhibitörler veya ilaçlar içerir ve toplam hacmi 500 mikrolitre çıkarır. Plaka artık Seahorse biyoanalizöründeki kalibre edilmiş sensör kartuşuyla testi çalıştırmaya hazırdır. İlk olarak, elektron taşıma sistemi ile oksidatif fosforilasyon arasındaki bağlantı derecesini incelemek için bir bağlantı testi yapıyoruz.

Bağlantı testi, mitokondriyal fonksiyonu işlev bozukluğundan ayırt etmeye yardımcı olur. Mitokondriyal elektron taşıma sisteminin bu diyagramında, piruvat veya malate gibi farklı substratlar için düğümler ve sisteme elektronlar bağışlayan karmaşık bir, üç ve beş spesifik inhibitörü gösteriyoruz. Bu görselleştirme, testin nasıl çalıştığını ve çeşitli substratlar ile inhibitörlerin rolünü anlamak için faydalıdır.

İlk olarak, plazma zarı boyunca elektron taşınımını kolaylaştırma ve bağlantı testini mümkün kılan iki farklı digitonin konsantrasyonunu, beş mikromolar ve 10 mikromolar konsantrasyonunu inceliyoruz. Bu testte, solunum bağlanma seviyesi, substrat olarak suksinat ve karmaşık bir inhibitör olarak rotenon varoluşunda oksijen tüketim oranı ardışık olarak ölçülerek değerlendirildi. ADP, oligomisin, FCCP ve antimisin A ardışık olarak enjekte edildi ve her enjeksiyondan sonra OCR ölçümleri kaydedildi.

Sol panelde, geçici mikro odada oksijen geriliminin kinetik olduğunu gösteren çizgi grafikleri gösterilmektedir. Genellikle, bu değer sensörün dinamik aralığında tespit edilmesi için 100 ile 200 milimetre cıva arasında kalmalıdır. Bu veri setleri, Agilent Wave yazılımındaki noktadan noktaya mod kullanılarak oluşturulmuştur; bu yazılım, OCR'yi ölçüm süresi boyunca bir dizi hız olarak gösterir ve dinamik değişikliklerin görselleştirilmesini sağlar; özellikle 10 mikromolar digitoninin, beş mikromolara kıyasla süksinat taşınımını artırır, bu da mikro odada oksijen geriliminin azalmasına ve buna karşılık daha yüksek oksijen alımına yol açar.

Bu deneylerden elde edilen verilerin çizilmesi, iki ila dört komplekslerin aracılık ettiği bazal solunumun, 10 mikromolar digitonin'de beş mikromolara kıyasla anlamlı şekilde daha yüksek olduğunu ortaya koydu; bu da permeabilize plazma zarı üzerinden daha yüksek konsantrasyonda daha verimli suksinat taşınımını gösteriyor. Bu gözleme dayanarak ve 10 mikromolar digitoninin optimal geçirimlilik sağladığı göz önüne alındığında, hücre sayısını kuyuda 20.000 hücreye indirerek bazal solunumu azalttık. Bu ayarlama, ilaç veya substrat kaynaklı solunum takviyesinin sistemin dinamik tespit aralığı içinde kalmasını sağladı.

Digitonin konsantrasyonu ve hücre sayısı optimize edildikten sonra, muskarinik agonistlerin ve antagonistlerin mitokondriyal solunum üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir sonraki bağlantı testi yapıldı. Bu deney setinden önemli bir bulgu, digitonin işlememiş hücrelerde, suksinat kaynaklı kompleksler iki-dörd aralılıkla bazal solunumun yanı sıra State-3 ve State-3u solunumunun önemli ölçüde azaldığıdır. Bu, suksinatın permeabilize olmayan koşullarda hücreye taşınmadığını gösterir.

Birden fazla bağımsız deneyden elde edilen veriler çizildiğinde, muskarinik antagonist atropinin, nöroblastoma hücresinde iki ila dört kompleksin aracılık ettiği bazal solunumu önemli ölçüde azalttığını, yüksek solunum seviyesini koruyan muskarinik agonist asetilkolin ile karşılaştırıldığında gösterdi. Ayrıca, hem State-3 hem de State-3u solunum, permeabilize olmayan hücrelerde permeabilize hücrelere göre anlamlı derecede düşüktü ve bu da ditoninin mitokondriyal fonksiyonu bozmadan plazma zarını seçici olarak geçirimli hale getirmedeki etkinliğini vurguladı. Elektron akışı testi, elektronların mitokondriyal elektron taşıma zincirine ardışık transferini değerlendirir ve mitokondriyal işlev bozuklukları veya modülasyon mekanizmalarını belirlemeye yardımcı olur.

Testin ilk aşamasında, hücreler piruvat, malat ve FCCP ile işlendi; bu da birinci ila dört kompleksler tarafından yönlendirilen yüksek düzeyde bağlanmamış solunum indükledi. Sonrasında rotenon eklenmesi, temel solunumu azaltarak kompleks iki ila dört aktiviteyi izole ederek kompleks birinci sistemi inhibe etti. İlaçla tedavi edilen durumlar ile kontrol arasında anlamlı farklar gözlemlememize rağmen, önemli bir gözlem olarak, süksinat kaynaklı State-3u solunumunun permeabilize olmayan hücrelerde anlamlı derecede daha düşük olduğu, bu da digitoninin hücreye suksinatın girişini sağlayan kritik rolünü göstermektedir.

Özetle, bu protokol mitokondriyal biyoenerjiği incelemek için güvenilir bir yol sunar. Tüm hücre mimarisinin fizyolojik önemini, izole mitokondriyal testlerin hassasiyetiyle birleştirerek, organel bütünlüğünü korurken substratların ve inhibitörlerin kontrollü teslimatını sağlar. Digitonin konsantrasyonunu ve hücre yoğunluğunu optimize ederek, araştırmacılar doğru ve tekrarlanabilir ölçümler elde edebilirler.

Bu uyarlanabilir yaklaşım, mitokondriyal fonksiyonun reseptör aracılı modülasyonunu araştırmak için idealdir ve hastalık araştırmaları ile ilaç keşfi için güçlü bir platform sağlar.