Bütün Caenorhabditis elegans L4 larvalarda kromatin erişilebilirlik profili

Araştırmamız, epigenetik düzenlemenin gen ekspresyonunu nasıl şekillendirdiğine, özellikle kromatin erişilebilirliğinin farklı biyolojik koşullar altında gen aktivitesini nasıl kontrol ettiğine odaklanmaktadır. C.elegans'ta ATAC-seq, koruyucu kutikülü ile sınırlıdır. Bizim protokollerimiz, güvenilir kromatin erişilebilirliği analizi sağlamak için bu engeli aşar.

Başlamak için, senkronize bir L1 solucan popülasyonu elde edin ve onların 20 derece Celsius'ta 26 saat boyunca büyümelerine izin verin. Mikroskop altında, solucanların çoğunun L4 aşamasında olduğunu doğrulayın. Tüm solucanları M9 tamponu ile plakalardan toplayın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Solucanları beş kez bir mililitre steril su ile yıkamak için, yerçekimiyle yerleşmelerini bekleyin. Ardından, solucanları içeren tüpü 25 derece Celsius'taki bir inkübatöre 30 dakika yerleştirin, böylece bağırsaktaki yiyecek kalıntıları çıkarılır. Ardından solucan peletinden 50 mikrolitre alın ve yeni bir tüpe koyun.

Solucanları liz etmek için, 200 mikrolitre taze SDS-DTT tamponu ekleyin ve tam olarak beş dakika boyunca bir tüp döndürücüde karıştırın. Ardından, bir mililitre soğuk yumurta tamponu ekleyin. Sonra bir picofuge'de süpernatantı çıkarmak için döndürün ve altı kez tekrarlayın.

Bunun ardından, 80 mikrolitre taze hazırlanmış pronaz ekleyin. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, filtreli uçlu solucan-pronaz karışımını 70 kez karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. 800 mikrolitre L15 %10 fetal bovin serum ortamı ekleyin ve dört derece Celsius'ta 500G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın.

Süpernatantın çıkarılmasından sonra, bir mililitre L15 %10 fetal bovin serum ortamı ekleyin ve önceden gösterildiği gibi santrifüj yapın. Pelet üç kez yıkandıktan sonra, süpernatantı çıkarın ve peleti 900 mikrolitre L15 %10 fetal bovin serum ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, süspansiyonu 20 mikrometrelik bir filtre kullanarak süzün.

Süzülmüş hücre süspansiyonunu dört derece Celsius'ta 500G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın. Ardından süpernatantı çıkarın, yaklaşık olarak 50 mikrolitre bırakarak, 45 mikrolitre taze hazırlanmış lizis tamponu ekleyin ve örneği dikkatlice yeniden süspanse edin.

Dikkatlice, örneği karıştırmadan 50 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Dört derece Celsius'ta 500G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve örneği buz üzerinde tutun.

Santrifüj yaparken, örnek başına TN5 karışımını 25 mikrolitre TN5 tamponu, 24,8 mikrolitre nükleozu olmayan su ve 0,2 mikrolitre TN5 enzimi kombine ederek hazırlayın. Santrifüjden sonra, süpernatantı çıkarın ve çekirdekler buz üzerinde kalsın. Nükleer pelete 50 mikrolitre TN5 karışımı ekleyin.

Daha sonra, karıştırmak için yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 37 derece Celsius'ta 30 dakika boyunca bir termal blokta inkübe edin ve her 10 dakika bir tüpü hafifçe vurun. TN5 inkübasyonundan sonra, 300 mikrolitre PB tamponu ekleyin ve maksimum hızda 25 saniye boyunca vorteks ile karıştırın.

Tüpün tüm hacmini döndürme kolonuna aktarın. Oda sıcaklığında maksimum hızda bir dakika boyunca santrifüj yapın. Dönüşüm kolonuna 750 mikrolitre PE tamponu ekleyin ve tekrar santrifüj yapın.

Daha sonra, toplanma tüpüyle birlikte süpernatantı atın. Boş bir döndürmeden sonra, kolonu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin. Kolonun ortasına 37 derece Celsius'ta 10 mikrolitre EB tamponu ekleyin, ancak kolona dokunmayın.

Bir dakika boyunca oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra, oda sıcaklığında maksimum hızda bir dakika boyunca santrifüj yapın. Son olarak, EB tamponunda son 20 mikrolitre hacminde elüsyon adımlarını tekrarlayın.

ATAC kütüphane amplifikasyonu için uygun döngü amplifikasyon sayısını tahmin etmek için gerçek zamanlı bir PCR gerçekleştirin. Her örnek için amplifikasyon sinyalinin maksimum değerinin 1/3'üne ulaştığı döngüyü seçerek son amplifikasyon döngüsü sayısını tahmin edin. ATAC kütüphanesi için son amplifikasyonu gerçekleştirin ve her örnek için farklı bir ters primer atayın ve kaydedin.

Her örnek için tahmin edilen döngü sayısı kadar amplifikasyon gerçekleştirin. Sunulan polimeraz zincir reaksiyonunu 50 mikrolitre toplam reaksiyon hacmindeki 10 mikrolitre DNA kütüphanesi kullanarak 200 mikrolitrelik tüplerde gerçekleştirin. Protokolü duraklatırsanız numuneleri eksi 20 derece Celsius'ta saklayın.

Amplife kütüphaneyi saflaştırdıktan sonra, fragman boyutu dağılımı desenini görmek için kılcal elektroforez gerçekleştirin. Son kütüphane amplifikasyonunun 15 döngüden az olduğu tahmin edilen amplifikasyon eğrisi, devam etmek için uygun olan kaliteli malzemeyi gösterir. Artık gecikmeli bir artış gösteren amplifikasyon e