RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu
April 17th, 2026
Bu protokol, paraformaldehit sabitlenmiş, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşen gömülü fare karaciğer dokusunun tanımlı histolojik bölgelerinden RNA'yı lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak izole etme yöntemini tanımlar; böylece hedefe yönelik aşağı akım gen ekspresyonu analizi mümkün olur.
Araştırmamız esas olarak hepatositlerle ilişkili patofizyolojiyi kronik karaciğer hastalıkları bağlamında incelemektedir. Bu protokol, karaciğer dokusu dilimlerinde hücre izolasyonu ve RNA ekstraksiyonunu mümkün kılar. FFPE veya Paraformaldehit sabit veya CT protokollerinin aksine, protokolü koruyup itekleşir, böylece hassas mikro tartışma ve yüksek kaliteli örnekler için aşağı akış OMI analizi sağlanır.
Başlamak için kalem membranı slaytlarını ultraviyole ışığa dört 30 dakika maruz bırakın. Slaytları mililitrede 0,1 miligram poli L lizin ile kaplayın ve hava kurumasına izin verin. Her sürgün kenarlarını nötr montaj ortamıyla mühürleyin.
RNase dekontaminasyon ajanı kullanarak, kriyostatın ve tüm aletlerin erişilebilen tüm yüzeylerini silin. %75 etanol kullanıyorum. Fırçayı ve aletleri iyice temizleyin.
Şimdi, kriyostat sıcaklığını eksi 20 derece Celsius'a ayarlayın ve stabilleşmesine izin verin. Karaciğer örneklerini -80 derece Celsius deposundan alın. Numuneleri denge için en az 15 dakika kriostat odasına yerleştirin.
Örnek aşamasına iki ila üç milimetre kalınlığında OCT bileşiği tabakası uygulayın. Sonra örnek aşamasını hızlı bir serbest rafa veya kriyostat odasının içine yerleştirerek bileşik tabakayı önceden katılaştırın. Önceden katılaşmış tabakaya az miktarda OCT bileşiği uygulandıktan sonra, dengelenmiş doku bloğunu yatay olarak bileşiğin üzerine yerleştirin ve 10-15 saniye boyunca yerinde tutun.
Sonra örnek aşamasını bağlı doku bloğuyla birlikte kriyostat örnek başlığına monte edin. Şimdi bıçağı dikkatlice kriyostatın bir tarafındaki kelepçe plakaları ile arka plakaların arasına yerleştirin. Bıçağı sabitlemek için kelepçe kolunu kelepçeleyin.
Kriyostat kalınlığını 10 mikrometreye ayarlayın. Dokuyu bölümlere ayırın ve doğrudan önceden işlenmiş kalem membran slaytlarına kriostat odasındaki en 20 derece sıcaklıkta monte edin. Sürgüleri oda sıcaklığında 20 dakika eritin.
Slaytları RN ACE free PBS ile üç kez yıkayın, her yıkamada dört 10 saniye bekleyin. Süzülmüş Mayer'in hematoksilin çözeltisini doku kesitlerine beş ila on saniye boyunca ekleyin. Sonra slaytları ribonükleaz içermeyen suyla her yıkamada 10 saniye boyunca üç kez yıkayarak kalan hematoksilin gider.
Lekeleme kalitesini mikroskop altında değerlendirin. Emici kağıt kullanarak, slaytları kurutup tamamen hava ile kurutmaya bırakın. Laboratuvar tezgahı yüzeyini RNase dekontaminasyon ajanı ile silin.
Kontrolciyi açın ve mikroskobun başlatmayı tamamlamasına izin verin. Lazer sistemini başlatmak için anahtarı kapalı konumdan açık pozisyona saat yönünde döndürün. Bilgisayarı açın ve lazer yakalama mikro diseksiyon yazılımını başlatın.
Sonra başlatmanın tamamlanmasını bekle. Şimdi toplama cihazına steril bir 0.2 mililitrelik PCR tüpü takın. Pipet kullanarak, PCR tüpünün kapağına 10 mikrolitre proteaz K sindirim tamponu ekleyin.
Toplama cihazını mikroskop numune tutucusuna yükleyin. Koleksiyoncu cihazını değiştirme penceresinde. Referans noktasını ayarlamaya gidin, kamera odakını referans noktasını net görecek şekilde ayarlayın ve gerekirse ok kontrolleriyle ortala.
Bir doku kesitini numune tutucusuna yerleştirin, doku aşağıya bakacak ve etiket konumu sağa dönük. 10 x objektif merceği seçin ve belirli patolojik özelliklere sahip ilgi çekici bölgeleri belirleyin. Lazer menüsüne gidin.
Kalibrasyon tuşuna tıklayın, evet seçin ve kalibrasyonu tamamlayın. Lazer kontrol panelinde lazer gücünü 50, diyaframı beşe ve hızı dokuza ayarlayın. Sonra grafik araç çubuğunu kullanarak hedef alanın etrafında bir daire çizin.
Tek şekil seçin, lazerle yakalama mikro diseksiyon yapmak için başlat kesim tuşuna basın ve diseksiyon yapan dokuyu toplamak için toplama cihazını konumlandırın. Dokümantasyon ve görselleri yakalamak için, tercih edilen formatta önce ve sonra görüntüleri kaydetmek için dosyayı seçip kaydet. İstenilen hücreler toplandıktan sonra, kollektörü aşamadan çıkarmak için boşaltma tuşuna tıklayın.
10 mikrolitre proteaz K sindirim tamponunun kapsülde kaldığını kontrol edin ve gerekirse yenileyin. Tüpü kapatın ve iyice girdabla girdep yapın. Sonra tüpü kısa bir süre santrifüjde döndürün.
Tüpü RNA çıkarımı ile -80 derece Celsius'ta sakla. Kalem slaytındaki hematoksilin boyalı karaciğer bölümü, lazer yakalama mikrodiseksiyonundan önce ve sonra mikroskop altında görselleştirildi. Mikroveziküler steatoz gösteren ilgi çekici bölgeler A PCR tüpünün kapağına tam olarak toplanmıştır.
Sağlam hücresel morfolojinin korunması. Yaklaşık 1000 ve 2000 lazer yakalama mikrodiseksiyon hücrelerinden çıkarılan toplam ribonüklein asit, sırasıyla 110,7 nanogram ve 213,3 nanogram elde etti. Tüm örneklerde 1.9 ile 2.1 arasında 260x280 nanometre oranlarında yüksek saflık gösterildi.
Jel elektroforezi, belirgin 28 s ve 18 s ribozomal ribo nükleik asit bantları ortaya koydu. Biyoanalizör profilleri, en azı 1000 hücreden ribonüklein asit. Ribonüklein asit bütünlük sayısı 6.7 oldu.
Ev işleri geni Beta aktinin Q-R-T-P-C-R döngü eşik değerleri 17 ile 19 arasında değişiyordu. 50 nanogram toplam ribonükleik asidden oluşturulan dizileme kütüphanelerinin biyoanalizör değerlendirmesi, 300 ile 500 baz çifti arasında karakteristik bir zirve göstermiştir. Bu kütüphanelerin RNA dizilemesi, hem Q 20 hem de Q 30 puanlarıyla yüksek kaliteli veriler sağladı, %90'ı aştı ve tekrarlar arasında düşük hata oranı sağladı.
Önemli bir husus, kontrollü kesme, hızlı boyama ve düz koşullar yoluyla degradasyonun önlenmesidir. Bu prosedürü sıralayarak, gerçek zamanlı PCR ve parçalanma optimize edilmiş kütüphane anahtarlarıyla dizileme için kullanılabilir. Karaciğer örneklerinde belirlenmiştir.
Bu protokol, hepatosit alt grubu profilini sağlar ve patoloji odaklı hepatoloji araştırmalarını destekler.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a detailed protocol for laser capture microdissection (LCM) and RNA extraction from paraformaldehyde (PFA)-fixed, OCT-embedded mouse liver sections. The method enables the isolation of specific histological regions for downstream transcriptomic analyses, ensuring high RNA purity and integrity suitable for sensitive applications such as qPCR and RNA sequencing.
Key Study Components
Area of Science
- Hepatology
- Molecular Biology
- Histology
Background
- Chronic liver diseases often require spatially resolved molecular analysis of hepatocyte subpopulations.
- Traditional FFPE methods can compromise RNA integrity, limiting downstream applications.
- LCM allows precise isolation of defined cell populations from complex tissues.
- PFA fixation and OCT embedding preserve tissue morphology and RNA quality for transcriptomic studies.
Purpose of Study
- To establish a robust protocol for isolating specific liver cell populations using LCM from PFA-fixed, OCT-embedded tissue.
- To extract high-quality RNA suitable for transcriptomic analysis from microscale samples.
- To validate the protocol's effectiveness for downstream applications such as qPCR and RNA sequencing.
Methods Used
- Preparation of pen membrane slides with UV exposure and poly-L-lysine coating.
- Cryosectioning of PFA-fixed, OCT-embedded mouse liver at -20°C.
- Hematoxylin staining and RNase-free handling throughout the workflow.
- Laser capture microdissection of histologically defined regions (approx. 1,000 cells).
- RNA extraction, quantification, and quality assessment (A260/A280 ratio, RIN, gel electrophoresis).
- Downstream validation by qPCR for β-actin and RNA sequencing with fragmentation-optimized library preparation.
Main Results
- RNA yields from 1,000–2,000 cells ranged from 110.7 to 213.3 ng.
- RNA purity was high (A260/A280: 1.9–2.1).
- RNA integrity number (RIN) averaged 6.7 ± 0.9, consistent with PFA fixation.
- qPCR for β-actin showed Ct values of 17–19, indicating good RNA quality.
- RNA-seq libraries showed characteristic peaks (300–500 bp) and >90% of bases at Q20/Q30 quality thresholds.
Conclusions
- This protocol enables precise, spatially resolved gene expression analysis in liver tissue.
- RNA extracted is of sufficient purity and integrity for sensitive downstream applications.
- The method supports hepatocyte subgroup profiling and pathology-focused hepatology research.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection (LCM) of paraformaldehyde-fixed, OCT-embedded mouse liver tissue enables spatially resolved transcriptomic profiling of defined cell populations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-purity RNA suitable for sensitive downstream analyses, facilitating confident target validation and disease-relevant pathway interrogation. The protocol addresses a critical inflection point for hepatology and pathology-focused R&D portfolios seeking robust, region-specific molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially precise interrogation of hepatocyte subgroups within complex liver tissue.
- Supports functional target validation by isolating histologically defined regions for RNA analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular signatures to specific pathological features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing high-quality, region-specific RNA data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream qPCR and RNA sequencing workflows.
- Ensures assay reproducibility through standardized tissue processing and RNA quality metrics.
- Delivers quantitative outputs (e.g., Ct values, RNA integrity) for reliable compound evaluation.
- Enables platform reuse for multiple transcriptomic applications in liver disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant histopathology for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting sensitive RNA-based analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by ensuring sample integrity and data quality.
- Supports pathology-driven research in chronic liver disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This LCM protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling targeted gene expression analysis from fixed tissue sections, bridging histological assessment and molecular readouts.
- Discovery Biology: Provides spatially resolved hypothesis testing and pathway clarification in liver tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development and validation.
- Analytics: Supplies high-purity RNA and robust quality metrics (A260/A280, RIN, Ct values) for comparative analyses.
- Translational Research: Connects histopathological features to transcriptomic profiles for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics in fixed tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, histological staining, and LCM instrumentation.
- Demands access to RNase-free facilities and analytical infrastructure for RNA quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for other tissue types or disease models with validation.
- RNA integrity is inherently limited by PFA fixation but remains suitable for qPCR and RNA-seq.
