RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu

Araştırmamız esas olarak hepatositlerle ilişkili patofizyolojiyi kronik karaciğer hastalıkları bağlamında incelemektedir. Bu protokol, karaciğer dokusu dilimlerinde hücre izolasyonu ve RNA ekstraksiyonunu mümkün kılar. FFPE veya Paraformaldehit sabit veya CT protokollerinin aksine, protokolü koruyup itekleşir, böylece hassas mikro tartışma ve yüksek kaliteli örnekler için aşağı akış OMI analizi sağlanır.

Başlamak için kalem membranı slaytlarını ultraviyole ışığa dört 30 dakika maruz bırakın. Slaytları mililitrede 0,1 miligram poli L lizin ile kaplayın ve hava kurumasına izin verin. Her sürgün kenarlarını nötr montaj ortamıyla mühürleyin.

RNase dekontaminasyon ajanı kullanarak, kriyostatın ve tüm aletlerin erişilebilen tüm yüzeylerini silin. %75 etanol kullanıyorum. Fırçayı ve aletleri iyice temizleyin.

Şimdi, kriyostat sıcaklığını eksi 20 derece Celsius'a ayarlayın ve stabilleşmesine izin verin. Karaciğer örneklerini -80 derece Celsius deposundan alın. Numuneleri denge için en az 15 dakika kriostat odasına yerleştirin.

Örnek aşamasına iki ila üç milimetre kalınlığında OCT bileşiği tabakası uygulayın. Sonra örnek aşamasını hızlı bir serbest rafa veya kriyostat odasının içine yerleştirerek bileşik tabakayı önceden katılaştırın. Önceden katılaşmış tabakaya az miktarda OCT bileşiği uygulandıktan sonra, dengelenmiş doku bloğunu yatay olarak bileşiğin üzerine yerleştirin ve 10-15 saniye boyunca yerinde tutun.

Sonra örnek aşamasını bağlı doku bloğuyla birlikte kriyostat örnek başlığına monte edin. Şimdi bıçağı dikkatlice kriyostatın bir tarafındaki kelepçe plakaları ile arka plakaların arasına yerleştirin. Bıçağı sabitlemek için kelepçe kolunu kelepçeleyin.

Kriyostat kalınlığını 10 mikrometreye ayarlayın. Dokuyu bölümlere ayırın ve doğrudan önceden işlenmiş kalem membran slaytlarına kriostat odasındaki en 20 derece sıcaklıkta monte edin. Sürgüleri oda sıcaklığında 20 dakika eritin.

Slaytları RN ACE free PBS ile üç kez yıkayın, her yıkamada dört 10 saniye bekleyin. Süzülmüş Mayer'in hematoksilin çözeltisini doku kesitlerine beş ila on saniye boyunca ekleyin. Sonra slaytları ribonükleaz içermeyen suyla her yıkamada 10 saniye boyunca üç kez yıkayarak kalan hematoksilin gider.

Lekeleme kalitesini mikroskop altında değerlendirin. Emici kağıt kullanarak, slaytları kurutup tamamen hava ile kurutmaya bırakın. Laboratuvar tezgahı yüzeyini RNase dekontaminasyon ajanı ile silin.

Kontrolciyi açın ve mikroskobun başlatmayı tamamlamasına izin verin. Lazer sistemini başlatmak için anahtarı kapalı konumdan açık pozisyona saat yönünde döndürün. Bilgisayarı açın ve lazer yakalama mikro diseksiyon yazılımını başlatın.

Sonra başlatmanın tamamlanmasını bekle. Şimdi toplama cihazına steril bir 0.2 mililitrelik PCR tüpü takın. Pipet kullanarak, PCR tüpünün kapağına 10 mikrolitre proteaz K sindirim tamponu ekleyin.

Toplama cihazını mikroskop numune tutucusuna yükleyin. Koleksiyoncu cihazını değiştirme penceresinde. Referans noktasını ayarlamaya gidin, kamera odakını referans noktasını net görecek şekilde ayarlayın ve gerekirse ok kontrolleriyle ortala.

Bir doku kesitini numune tutucusuna yerleştirin, doku aşağıya bakacak ve etiket konumu sağa dönük. 10 x objektif merceği seçin ve belirli patolojik özelliklere sahip ilgi çekici bölgeleri belirleyin. Lazer menüsüne gidin.

Kalibrasyon tuşuna tıklayın, evet seçin ve kalibrasyonu tamamlayın. Lazer kontrol panelinde lazer gücünü 50, diyaframı beşe ve hızı dokuza ayarlayın. Sonra grafik araç çubuğunu kullanarak hedef alanın etrafında bir daire çizin.

Tek şekil seçin, lazerle yakalama mikro diseksiyon yapmak için başlat kesim tuşuna basın ve diseksiyon yapan dokuyu toplamak için toplama cihazını konumlandırın. Dokümantasyon ve görselleri yakalamak için, tercih edilen formatta önce ve sonra görüntüleri kaydetmek için dosyayı seçip kaydet. İstenilen hücreler toplandıktan sonra, kollektörü aşamadan çıkarmak için boşaltma tuşuna tıklayın.

10 mikrolitre proteaz K sindirim tamponunun kapsülde kaldığını kontrol edin ve gerekirse yenileyin. Tüpü kapatın ve iyice girdabla girdep yapın. Sonra tüpü kısa bir süre santrifüjde döndürün.

Tüpü RNA çıkarımı ile -80 derece Celsius'ta sakla. Kalem slaytındaki hematoksilin boyalı karaciğer bölümü, lazer yakalama mikrodiseksiyonundan önce ve sonra mikroskop altında görselleştirildi. Mikroveziküler steatoz gösteren ilgi çekici bölgeler A PCR tüpünün kapağına tam olarak toplanmıştır.

Sağlam hücresel morfolojinin korunması. Yaklaşık 1000 ve 2000 lazer yakalama mikrodiseksiyon hücrelerinden çıkarılan toplam ribonüklein asit, sırasıyla 110,7 nanogram ve 213,3 nanogram elde etti. Tüm örneklerde 1.9 ile 2.1 arasında 260x280 nanometre oranlarında yüksek saflık gösterildi.

Jel elektroforezi, belirgin 28 s ve 18 s ribozomal ribo nükleik asit bantları ortaya koydu. Biyoanalizör profilleri, en azı 1000 hücreden ribonüklein asit. Ribonüklein asit bütünlük sayısı 6.7 oldu.

Ev işleri geni Beta aktinin Q-R-T-P-C-R döngü eşik değerleri 17 ile 19 arasında değişiyordu. 50 nanogram toplam ribonükleik asidden oluşturulan dizileme kütüphanelerinin biyoanalizör değerlendirmesi, 300 ile 500 baz çifti arasında karakteristik bir zirve göstermiştir. Bu kütüphanelerin RNA dizilemesi, hem Q 20 hem de Q 30 puanlarıyla yüksek kaliteli veriler sağladı, %90'ı aştı ve tekrarlar arasında düşük hata oranı sağladı.

Önemli bir husus, kontrollü kesme, hızlı boyama ve düz koşullar yoluyla degradasyonun önlenmesidir. Bu prosedürü sıralayarak, gerçek zamanlı PCR ve parçalanma optimize edilmiş kütüphane anahtarlarıyla dizileme için kullanılabilir. Karaciğer örneklerinde belirlenmiştir.

Bu protokol, hepatosit alt grubu profilini sağlar ve patoloji odaklı hepatoloji araştırmalarını destekler.