Fare Kornealarından Tek Hücreli Süspansiyonun Hasat İçin Bir Protokol
3 Nisan 2026
Burada, kollajenaz A ve tripsin ile ardışık sindirim yoluyla tüm fare kornealarından yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, yüksek RNA bütünlüğüne sahip geçerli tek hücreler sağlar ve bu da onları tek hücreli RNA dizileme ve akış sitometriy gibi sonraki uygulamalarla uyumlu kılar.
Bu protokol, öncelikle sağlam fare kornealarından yüksek kaliteli tek hücre elde etme yöntemini tanıtır. Yöntemimiz, yüksek RNA bütünlüğüne sahip uygulanabilir tek hücrelerdir; bu da onları kalın ince ve akış diyametri üzerinde tek hücre gibi sonraki uygulamalarla uyumlu kılar. Başlamak için, altı ila sekiz haftalık bir dişi C57BL6 faresini steril bir diseksiyon masasına yerleştirin.
Kapalı göz kapakları PBS ile duruladıktan sonra, göz küresinin arka kutbu boyunca bir kesi açmak için oftalmik makas kullanın ve izole edilen gözü, buz gibi hormonal epitel ortamı içeren Petri kabına dikkatlice yerleştirin. Göz küreğini %5 penisilin streptomisin takviyesi ile 1XPBS ile üç kez durulattıktan sonra, oftalmik makas ve pens kullanarak arka kutuptan kornea limbüsüne doğru bir kesi yapın. Korneayı skleradan ve konjonktivadan limbal sınır boyunca nazikçe ayırın, ardından iki çift forseps kullanarak lens ve irisi tamamen çıkarın.
Kornea dokusunu PBS'de üç kez yıkandıktan sonra, temiz dokuyu yeni bir tüpe aktarın. Mililitre başına beş miligram kollajenaz A çözeltisi ekleyin ve dokuyu oftalmik makasla yaklaşık 0,5 x 0,5 milimetre boyutlarında parçalara indirin. Kornea parçalarını içeren tüpü kollagenaz A çözeltisi ile hücre kültürü inkübatöründe 37 derece Celsius sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.
Sindirim sırasında dokuyu her 10 dakikada bir kontrol edin. Büyük doku parçaları kalmayınca, numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300G santrifüjlenin, ardından süpernatantı dikkatlice aspire edin. Sonra pelleti %0,25 tripsin EDTA çözeltisi içeren 200 mikrolitre ile tekrar süspansiyona alın.
Tüpü kalan doku parçalarını sindirmek için 10 dakika boyunca 37 derece Celsius sıcaklığına ayarlanmış bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Son olarak, geniş bir delik ucu bulunan bir P1000 pipeti kullanarak karışımı nazikçe tritüre ederek tek hücreli süspansiyon elde edin. Daha önce gösterildiği gibi hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve hücre pelletini %0,04 BSA içeren PBS ile yeniden süspansiyona alın.
İzole kornea hücreleri hemositometre kullanılarak sayıldığında, ortalama hücre canlılığı %94,6 ve tek hücre oranı %96,3'ü üzerinde, toplam 1,05 kat 10 beş hücre gücüne ulaştığı bulundu; bu da süspansiyonun aşağı akış uygulamaları için uygunluğunu doğruladı. İmmünofluoresans analizi, hücre süspansiyonunun %83,5 pan-CK-pozitif epitel hücresi, %13,5 keratokan pozitif stromal hücre ve yaklaşık %3 her iki belirteç için negatif hücre içerdiğini göstermiştir. Tek hücreli süspansiyondan çıkarılan RNA, yaklaşık 8.8 kadar yüksek RNA bütünlük sayısı ve yaklaşık 2.15 olan 28S x 18S ribozomal RNA oranı göstererek mükemmel RNA kalitesini doğruladı.
Tek hücre elde ettikten sonra, kornea hücresi fonksiyonunu ve yüzey işareti keşfini karakterize edebiliriz. Bu civarda hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesi yer alıyor. Bu yöntemdeki zorluklardan biri, korneayı diğer dokulardan neredeyse ayırmaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, bütün fare kornealarından yüksek kaliteli tek hücre süspansiyonları izole etmek için sağlam bir protokol sunmaktadır. Yöntem, hassas doku diseksiyonunu ardışık enzimatik sindirimle birleştirerek, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) ve akış sitometrisi gibi aşağı akış uygulamaları için uygun, canlı tek hücrelerin hazırlanmasına olanak tanır. Protokol, yüksek hücre sayıları ve mükemmel canlılık sağlar ve RNA bütünlüğünü koruyarak korneal hücresel heterojenliğin ayrıntılı analizini kolaylaştırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Oftalmoloji
- Hücre Biyolojisi
- Tek Hücre Analizi
Arka Plan
- Kornea, görme ve oküler yüzey homeostazı için temel olan gözün en dış tabakasıdır.
- Tek hücre RNA dizileme (scRNA-seq), yüksek kaliteli tek hücre süspansiyonları gerektirir.
- Kornea dokusu yoğun ve karmaşıktır, bu da hücre ayrıştırmasını zorlaştırır.
- Mevcut protokoller genellikle düşük hücre canlılığına veya yetersiz RNA kalitesine yol açmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Bütün mouse kornealarından tek hücre süspansiyonları oluşturmak için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- Ardışık uygulamalar için yüksek hücre canlılığı ve RNA bütünlüğü sağlamak.
- Temel kornea hücre tiplerinin doğru şekilde tanımlanmasını ve miktarının belirlenmesini mümkün kılmak.
Kullanılan Yöntemler
- Ötanize edilmiş C57BL6 farelerinden korneaların diseksiyonu.
- Kollajenaz A ve tripsin-EDTA kullanılarak ardışık enzimatik sindirim.
- Tek hücre süspansiyonu elde etmek için mekanik parçalama ve nazik tritürasyon.
- Trypan blue boyama ve hemositometre sayımı ile hücre canlılık değerlendirmesi.
- Pancytokeratin (epitel hücreler) ve Keratocan (stromal hücreler) için immünofloresan boyama.
- Bir biyoanalizör kullanılarak RNA bütünlük analizi.
Ana Sonuçlar
- Sekiz korneadan yaklaşık 1.05 × 105 hücre elde edildi.
- Yüksek hücre canlılığı (%94,6) ve tek hücre oranı (%96,3).
- Hücre kompozisyonu: %83,5 pan-CK-pozitif epitelyal hücreler, %13,5 keratokan-pozitif stromal hücreler, ~%3 her iki belirteç için negatif.
- RNA bütünlük numarası (RIN) ~8,8 ve 28S/18S rRNA oranı ~2,15 olup, bu değerler mükemmel RNA kalitesine işaret etmektedir.
Sonuçlar
- Protokol, fare kornealarından güvenilir bir şekilde yüksek kaliteli tek hücre süspansiyonları üretir.
- Hücre preparatları, scRNA-seq dahil olmak üzere zorlu alt uygulamalar için uygundur.
- Bu yöntem, kornea hücre fonksiyonlarının ve hücreler arası etkileşimlerin ayrıntılı çalışmalarını kolaylaştırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Fare kornealarından elde edilen yüksek kaliteli tek hücre süspansiyonları, keşif aşamasındaki oftalmik araştırmaları ilerletmek ve yüksek çözünürlüklü hücresel profillemeyi mümkün kılmak için gereklidir. Bu protokol, yoğun oküler dokudan canlı ve RNA'sı bozulmamış tek hücrelerin hazırlanmasındaki kritik bir darboğazı ele alarak, sonraki aşamalardaki tek hücre analizlerinin güvenilirliğini doğrudan etkiler. Güçlü hücre hazırlama süreci, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır ve keşif ile preklinik süreçler arasındaki translasyonel sürekliliği destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Kornea hücresel heterojenliğinin tek hücre çözünürlüğünde incelenmesine olanak tanır.
- Hücre canlılığını ve RNA bütünlüğünü koruyarak fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Doğru hücre tipi tanımlaması yoluyla mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırır.
- Erken evre oftalmik hedef seçimi için öngörü güvenilirliğini artırır.
Tarama & Analiz Geliştirme
- Analiz geliştirme için standardize edilmiş, yüksek canlılığa sahip tek hücre süspansiyonları sağlar.
- Ardıl tek hücre RNA sekanslama işlemleri için tekrarlanabilirliği ve kantitatif çıktıyı garanti eder.
- Ölçeklenebilir tarama iş akışları için valide edilmiş biyolojik materyal hazırlar.
- Bileşik etkilerinin farklı kornea hücre popülasyonları üzerindeki güvenilir değerlendirmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Doğal kornea hücresi çeşitliliğini koruyarak hastalıkla ilgili modellerle uyum sağlar.
- Translasyonel biyobelirteç keşfi ve doğrulaması için RNA kalitesini korur.
- Keşiften preklinik aşamalara kadar veri sürekliliğini sağlayarak risk ayarlı ilerleme kararlarını destekler.
- Preklinik oftalmik çalışmalardaki biyolojik belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu protokol, erken keşif ve preklinik araştırma arayüzünde entegrasyon sağlayarak, doku disosiyasyonundan tek hücre analizine ve ardından gelen fonksiyonel çalışmalara sorunsuz bir geçiş imkanı sunar.
- Keşif Biyolojisi: Yüksek doğrulukta tek hücre profilleme sağlayarak hipotez testlerini ve yolakların açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Analiz hazırlığı ve bileşik taraması için tekrarlanabilir, kantitatif tek hücre süspansiyonları sunar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler için güçlü hücre canlılığı, hücre tipi kantifikasyonu ve RNA bütünlüğü metrikleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç uyumu ve preklinik doğrulama için hücresel çeşitliliği ve RNA kalitesini korur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Oftalmik araştırma programları genelinde uyarlanabilir standart bir protokol oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir tek hücre hazırlıkları sağlar.
- Stratejik Değer: Bilgiye dayalı devam/durdur kararlarına olanak tanır ve oftalmik Ar-Ge'de sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Keşif aşamasındaki varlıkların risk ayarlı önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Oküler doku diseksiyonu ve enzimatik sindirim tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Hücre canlılığı analizleri, immünofloresans ve RNA bütünlük analizi cihazlarına erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilirlik ve veri karşılaştırılabilirliği için ekipler arası standartlaştırma gereklidir.
- Protokol optimizasyonu ile diğer yoğun doku tiplerine uyarlanabilir.
- Kontaminasyonu önlemek ve numune saflığını sağlamak için doku ayrımındaki hassasiyet kritiktir.
