Nötralize Antikor Titrlerini Ölçmek İçin Hepatit E Virüsü Flüoresans Azaltma Nötralizasyon Testi

Floresans indirgeme tabanlı nötrasyon testinin ana amacı, bir aşı adayı ve HEV'ye karşı antikorların nötralizasyon potansiyelini nicelikle ölçmektir. HEV'nin bilinen sitopatik yapısı PRND testini sınırlar. Bu protokol, enfekte hücreleri görselleştirmek ve daha sonra benimini görselleştirmek için bağışıklık temelli eğitim PRND'ye odaklanır. Başlamak için, yeni bölünmüş HuH-7 hücrelerini saymak.

Sonra, 12 kuyuyla bir plakaya mikroskopi kalitesinde cam kapağı yerleştirin ve %10 FBS takviyesi olan bir mililitre tam DMEM'de her kuyuda 0,2 milyon hücre tohumlanın. Hücreleri gece boyunca %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta kuluçka altına alın. Ertesi gün, tohumlanmış hücrelere dört genom kopyasının gücüne 1,8 kat 10 içeren 500 mikrolitre serumsuz ortam eklenin.

37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit ile bir saat kuluçka yapın. Hücreleri üç kez yıkamak için 500 mikrolitre DPBS kullanın. Kuyulara %2 FBS takviyesi olan iki mililitre DMEM ekleyin.

Hücreleri %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius sıcaklığında 72 saat boyunca kuluçka yapın. Hücreleri 500 mikrolitre DPBS ile üç kez yıkayın, her yıkama arasında oda sıcaklığında beş dakika kuluçka yapın. Hücrelere 500 mikrolitre %4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.

Daha sonra hücreleri daha önce gösterildiği gibi DPBS ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında DPBS'de 30 dakika kuluçka yapın. DPBS içinde %5 normal keçi serumu, %0,5 sığır serumu albümini ve %0,3 Triton X100 içeren 250 mikrolitre bloklayıcı çözelti ekleyin.

Oda sıcaklığında bir saat boyunca bir shaker'da kuluçka yapın. Bloklayıcı çözeltiyi çıkarın ve 500 mikrolitre DPBS ile bir kez yıkayın. Sonra 250 mikrolitre primer antikor çözeltisi bir-500 seyreltme ile ekleyin.

Hücreleri gece boyunca dört derece Celsius'ta kuluçka edin. Ertesi gün, hücreleri daha önce gösterildiği gibi üç kez DPBS ile yıkayın. Bire 1000 000 seyreltme ile 100 mikrolitre ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca humified bir odada kuluçka yapın.

Daha önce gösterildiği gibi yıkama kuluçka döngüsünü gerçekleştirin. Cam slayta DAPI ile 10 mikrolitre antiifade reaktifi ekleyin. Kapak kayışını, hücreler reaktife bakacak şekilde monte edin ve hava kabarcıklarından kaçının.

Kapak örtüsünü konfokal mikroskopi görselleştirmesi için oje ile kapatın. Yeni bölünmüş HuH-7 hücrelerini say. Sonra, 12 kuyruklu bir plakaya mikroskopi kalitesinde cam kapak kuşağı yerleştirin ve her kuyu başına bir mililitre tam DMEM'e 0,2 milyon hücre tohumlayın.

Ertesi gün, serumsuz ortamda anti-ORF2 ve tavşan immünoglobulin G antikorlarının on kat seri seyreltilmesi hazırlanır; başlangıç antikor konsantrasyonu mililitrede 25 mikrogram ve son seyreltme 10'a kadar -5 gücüne kadar alınır. Sulandırmanın son hacmi 100 mikrolitre olmalıdır. Sonra, her antikor seyreltmesine dört genom kopyasının gücüne 1,8 çarp 10 ekleyin.

Antikor virüs karışımını %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius sıcaklığında bir saat boyunca inkubka edin. Hücreleri 500 mikrolitre DPBS ile yıkayın. Antikor virüs karışımını hücrelere ekleyin.

37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit ile bir saat kuluçka yapın. Hücreleri 500 mikrolitre tampon ile yıkayın. DMEM'i %2 FBS ile ekledikten sonra, %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta 72 saat kuluçka yapın.

Daha önce gösterildiği gibi hücreleri immünofluoresan boyama için işleyin. Floresans görüntülerini edindikten sonra ImageJ yazılımını açın. Dosya'yı seçin ve görseli açın.

Sonra, Image, Type'ı seçin ve RGB görüntünü 8-bit formatına dönüştürmek için 8-bit tuşuna tıklayın. Eşiği ayarlayarak Görüntü ve Ayarlama, ardından Eşik Seviyesini seçerek alt seviyeyi 40, üst seviyeyi ise 255 olarak ayarlayın. Analiz et, Parçacıkları Analiz Et seçeneğini seçin ve sonuçları göster, Sonuçları Temizle, Özetle, Kenarlarda Dışlama ve İlgilendirici bölgeleri etkinleştirin.

Sonra floresan nokta sayılarını almak için Ok'a tıklayın. Verilen formülü kullanarak yüzde nötralizasyon ve Log10 NT50'nin antilogu olarak NT50'yi hesaplayın. Tüm alanların ortalama ve standart sapmasını gösteren grafiği çizin.

Enfekte hücrelerde, sahte enfekte hücrelere kıyasla önemli bir g1-HEV ribonüklein asit seviyesi tespit edilmiştir. Anti-ORF2 antikoru kullanılarak yapılan immünoflüosans testi, enfekte HuH-7 hücrelerinde ORF2 ekspresyonunu doğruladı. Anti-ORF2 antikorunun %50 nötralizasyon titresi 2,1 çarpı 10 üçlük olarak tahmin edildi.

Temsilci görüntüler, floresans azaltma nötralizasyon testinde sahte enfekte ve g1-HEV enfekte HuH-7 hücrelerinin görünümünü göstermektedir. Bu protokol, araştırmacıların anti-HEV antikorlarının nötralizasyon potansiyelini incelemelerine ve %50 nötralizasyon titrelerini ölçmesine olanak tanır. Bu protokolün kritik adımı, enfeksîyon hepatit E virüsünün izolasyonu ve doğru hücre boyaması ile yüksek çözünürlüklü görüntülerin alınmasıdır.

RT-qPCR ve ELISA gibi alternatif yöntemler nötralizasyon titresini belirlemek için kullanılabilir, ancak bazı sınırlamaları vardır.