Name: Sentetik bir K2P Kanalının Kaydı için Minyatürize Edilmiş Montal–Mueller Planar Lipid Çift Tabakası Sistemi Kullanılarak Tek Kanallı Elektrofizyoloji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Öğrenin, miniaturize Montal–Mueller planar lipid çift tabaka sistemi kullanarak tek kanallı elektrofizyoloji yöntemiyle sentetik K₂P iyon kanallarının fonksiyonel rekonstitüsyonunu ve kaydını nasıl gerçekleştireceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hücre transfeksiyon prosedürüne yardımcı olduğu için Sofia Diletta Guzzeloni'ye teşekkür ederiz. Elements çalışanları Dr. Leon Juarez ve Dr. Michelangelo Paci'ye minnettarız. Bu çalışma; İtalya Pavia Üniversitesi Moleküler Tıp Bölümü'nün Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027) girişimi, Cariplo Vakfı (#2019-1809) ve M.L.'ye yönelik PNRR Araştırma Programı CN00000013 “National Centre for HPC, Big Data and Quantum Computing” tarafından desteklenmiştir.

F.T. Elements S.r.l.'nin CEO'su, A.P. ise şirket çalışanıdır. Diğer tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.

Bu çalışmada, sentetik bir K2P kanalının elektrofizyolojik özelliklerini tek molekül düzeyinde değerlendirmek için PLB tekniğini kullandık. Bilimsel literatürde tanımlanan çeşitli düzlemsel lipid modelleri arasından, iki sulu bölmeyi ayıran dikey polar olmayan bir yüzeye delinmiş 50 ile 140 µm arasında çapa sahip bir açıklık üzerine boyanan BLM'lerin oluşturulmasına odaklandık. Bu konfigürasyon, lipid membran hazırlığı ve elektrolit bileşimi (örneğin, iyonik güç ve pH) dahil olmak üzere deneysel parametreler üzerinde kontrol sağlarken hücre membranı ortamının simüle edilmesine olanak tanır3. BLM'leri, iki sulu çözeltinin hava-su ara yüzeyine önceden yayılmış iki lipid tek tabakasının, su seviyesinin yükseltilmesiyle açıklık üzerinde birleşerek membranın kendiliğinden toplandığı Montal-Mueller (katlama) yöntemini5 kullanarak yeniden oluşturduk.
Burada sunulan membran oluşum protokolü oldukça sezgiseldir; ancak, birkaç kritik adım deneysel başarıyı güçlü bir şekilde etkilemektedir. BLMchipMM ile amplifikatör arasında uygun elektriksel bağlantıyı sağlamak için, PCB soketlerine yerleştirilen Ag/AgCl tel uçlarının klorlanmasından kaçınmak esastır. BLMchipMM montajı sırasında tellerin yanlış konumlandırılması, amplifikatör kasasıyla temasa yol açarak kısa devrelere ve sinyal doygunluğuna neden olabilir. Açıklık ön işlem prosedürü bir diğer kritik faktördür: ön işlem solüsyonunun uygulanması sırasında aşırı kuvvet uygulanması poliimid septuma zarar verebilirken, elektrolit solüsyonunun yanlış kullanımı —özellikle açıklık bölgesinin ıslatılması— membran oluşumunu bozabilir. Ayrıca, tekrarlanabilirlik için BLMchipMM kayıt odasının dikkatlice temizlenmesi esastır. %100 izopropil alkol kullanımı, ardından iyice durulama ve tamamen kurutma işlemi, kalıntıların sonraki deneylere müdahale etmemesini sağlar.
Protokol üzerinde çeşitli modifikasyonlar mümkündür. Çamaşır suyu ile emdirme yoluyla klorlama pratik ve yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olsa da, elektrokaplama gibi alternatif yöntemler de uygulanabilir43. Benzer şekilde, ön işlem ve lipid hazırlama süreçlerinde varyasyonlar yapılabilir. Standart ön işlem çözeltileri tipik olarak uçucu hidrokarbon çözücüler içinde çözülmüş uzun zincirli alkanlardan oluşur36; n-hekzan içinde %1 heksadekan çözeltisi yaygın olarak kullanılsa da diğer çözücüler de uygun olabilir. Lipid kompozisyonu da deneysel gereksinimlere bağlı olarak uyarlanabilir. DPhPC lipidleri optimal membran stabilitesi sağlarken, doğal veya sentetik kompozisyonlar dahil olmak üzere alternatif lipid karışımları da kullanılabilir36. Katlama yöntemiyle oluşturulan dikey lipid çift katmanlarının temel bir avantajı, her bir yaprağın farklı lipid türlerinden oluştuğu asimetrik membranlar oluşturabilme yeteneğidir5,22; bu özellik, membran protein fonksiyonunu etkilediği bilinmektedir.
Membran oluşumundaki sorunların giderilmesi genellikle sulu faz seviyelerinin ayarlanmasını içerir. Membran oluşumu başlangıçta gerçekleşmezse, bir bölmedeki tampon seviyesinin tekrarlanan şekilde düşürülmesi ve yükseltilmesi çift katman montajını kolaylaştırabilir. Başarısız olunması durumunda, açıklığın üzerine bir hava kabarcığı uygulamak lipid yeniden dağılımını ve membran oluşumunu teşvik edebilir. Devam eden başarısızlıklar genellikle ön işlem veya kontaminasyonla ilgili sorunlara işaret eder; bu durumda kayıt odasının temizlenmesi ve deneyin yeniden başlatılması önerilir.
Bu düzeneğin temel bileşenleri eNPR 100 kHz kompakt amplifikatör ve BLMchipMM'den oluşmaktadır. Amplifikatör, kasa yapısı kendi başına etkili bir elektromanyetik kalkan sağladığından, harici Faraday kafesleri dahil olmak üzere ek harici cihaz ihtiyacını ortadan kaldıran kompakt, düşük gürültülü bir voltaj klempleme sistemidir. BLMchipMM, amplifikatöre doğrudan bağlantı için bir PCB ile entegre edilmiş, önceden monte edilmiş, minyatürleştirilmiş bir kayıt odasıdır. Bu sistem, yapay membranın oluşturulduğu, konik uçlu lazer delikli bir açıklığa sahip poliimid bir septum ile ayrılmış iki C şeklinde bölmeden oluşur. Yaklaşık 110 µL bölme hacimlerine sahip olan sistemin düşük boyutları, reaktif tüketimini önemli ölçüde azaltır ve iç kapasitansı düşürerek sinyal kalitesini artırır. Ayrıca cihaz, uygun temizleme prosedürleri uygulandığında sökülmeden defalarca yeniden kullanılabilir, bu da değişkenliği azaltarak deneysel tekrarlanabilirliği artırır.
Bu avantajlara rağmen, bazı sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Mevcut düzenek; sıcaklık, basınç veya perfüzyon kontrolü için entegre modüller içermemektedir. İntrinsik membran geriliminin TREK144,45,46 gibi mekanosensitif kanalları etkilediği bildirilmiştir; ancak mevcut düzenek membran geriliminin kontrollü manipülasyonunu içermemektedir ve burada herhangi bir mekanistik sonuç çıkarılmamıştır. Genel olarak bu platform, yapay membranlarda iyon kanalı aktivitesinin kaydedilmesi için sağlam ve erişilebilir bir sistem sunmaktadır. Bu çalışmada, TREK alt ailesinin bilgisayarlı ortamda türetilmiş bir atasal kanalı olan sentetik K2P kanalı ancTREK1'i inceledik. Kaydedilen veriler, PLB'lere rekonstitüe edilen saflaştırılmış ancTREK1'in, bildirilen TREK1 benzeri iletkenlik özellikleri ile tutarlı tek kanal davranışı sergilediğini göstermektedir. Mg2+-içermeyen simetrik 200 mM potasyum koşulları altında kanal, 80 mV'ta yaklaşık 13 pA ve −80 mV'ta −19 pA genlik değerleri ile ölçülebilir I–V ilişkisi sergilemektedir. Ayrıca ancTREK1, TREK1 kanallarında gözlemlenen karakteristik yüksek iletkenlik modunu sergilemekte olup, negatif potansiyellerde (~205,6 pS) pozitif potansiyellere (~112,8 pS) kıyasla daha yüksek iletkenliğe sahiptir. Özellikle ancTREK1, eksize patch konfigürasyonlarındaki42 gözlemlerden farklı olarak, pozitif potansiyellerde artmış NPo (80 mV'ta 0,78) ve negatif potansiyellerde azalmış NPo (−80 mV'ta 0,53 ve −120 mV'ta 0,28) göstermektedir. Bu bulgular, sistemin rekonstitüe membran proteinlerinin prensip kanıtlama (proof-of-principle) tek kanal kayıtları için kullanımını desteklemektedir.

Siyah lipid membranlar (BLM'ler) olarak da bilinen yapay lipid çift katmanlı membranlara iyon kanallarının yeniden konfigüre edilmesi, iyon kanallarının tek molekül düzeyinde elektrofizyolojik karakterizasyonunu gerçekleştirmek için kullanılan yerleşik tekniklerden biridir1. BLM'lerin avantajları, yapılarından kaynaklanmaktadır. Nitekim, polar olmayan bir yüzeydeki bir gözenek içerisinde, iki sıvı çözeltiyi birbirinden ayıran düzlemsel bir lipid çift katmanı (PLB) oluşturulur. Böylece, biyolojik bir membranı taklit ederek, membran lipid kompozisyonu ve elektrolit veya kimyasal bileşik konsantrasyonları dahil olmak üzere yüksek derecede kontrollü koşullar altında iyon kanalı aktivitesinin kaydedilmesine olanak tanırken, her iki taraftan da erişilebilir kalır. Bu erişilebilirlik, iyon kanallarının örneğin miseller bir çözeltiden veya lipozom destekli füzyon yoluyla doğrudan yerleştirilmesine de izin verir2,3.
Tanımlanan ilk yapay membran sistemi, uçucu olmayan bir organik çözücü içinde çözünmüş bir lipid damlasının bir fırça yardımıyla küçük bir açıklığa uygulandığı boyama tekniği4 kullanılarak oluşturulmuştur. Açıklığın her iki yanına sulu bir çözeltinin eklenmesi, lipid çift tabakasının kendiliğinden oluşmasını sağlar. Ancak, bu yöntemin önemli bir dezavantajı, membranın özelliklerini etkileyebilecek solvent kalıntılarının kalmasıdır. Lipid çift tabakaları içindeki kalıntı organik solvent miktarını azaltmak için, "solventsiz" BLM'lerin oluşumuna olanak tanıyan katlama yöntemi5 geliştirilmiştir. Bu yaklaşımda, uçucu bir solvent içindeki lipid çözeltisi, iki monolayer oluşturmak üzere su yüzeyine yayılır ve sulu fazın seviyesi açıklığın üzerine kademeli olarak yükseltilerek, bu lipid monolayerlerin açıklık üzerinde katlanarak bir çift tabaka oluşturması sağlanır. Ancak, elde edilen BLM solventsiz olarak tanımlansa da, başarılı çift tabaka oluşumu için açıklığın ince bir uçucu olmayan solvent tabakasıyla ön işlemden geçirilmesi gerekir. Bu deneyler için gerekli olan temel unsur, küçük bir açıklığa (50–250 µm çapında) sahip lipofilik bir septum ile ayrılmış iki sulu bölmeden (genellikle cis ve trans olarak adlandırılır) oluşan bir kayıt odasıdır (Şekil 1). Her bir bölmeye gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) elektrotlar yerleştirilir. Elektrolit çözeltisine daldırıldıklarında, bu elektrotlar lipid çift tabakası ile kayıt cihazı arasında elektrokimyasal bağlantıyı kurar. Kayıt cihazı, transmembran potansiyelinin hassas kontrolünü ve gömülü por oluşturucu proteinlerden geçen iyonik akımların eş zamanlı ölçümünü sağlayan bir voltaj-clamp amplifikatöründen oluşur.
<img alt="Lipid çift tabaka iyon kanalı diyagramı; elektrofizyoloji düzeneği; kapalı/açık kanal durumları analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1: Planar lipid çift tabaka (PLB) elektrofizyoloji düzeneğinin şeması. PLB deneyleri için gerekli temel bileşenlerin şeması. Kayıt odası, lipid çift tabakasının oluştuğu bir açıklık içeren lipofilik bir septum ile birbirinden ayrılan iki sulu bölmeden (cis ve trans) oluşur. Her bölmedeki elektrolit çözeltiye gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) elektrotlar daldırılmıştır. Elektrotlardan biri voltaj uyarımları (örneğin sinüs, kare veya üçgen dalga formları) uygular; topraklanan diğer elektrot ise iyonik akımı orantılı bir voltaj sinyaline dönüştüren bir akım-voltaj dönüştürücüye bağlanır. Sinyal yükseltilir, isteğe bağlı olarak filtrelenir, dijitalleştirilir ve gerçek zamanlı izleme ile analiz için kaydedilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
BLM'leri oluşturmak için başka yöntemler de geliştirilmiştir. Bunlar arasında yaygın bir yaklaşım, bir patch-clamp pipetinin ucunda asılı lipid çift tabakaları oluşturmaktan oluşur. Buna göre, tip-dip yöntemi6, pipet ucunun hava-su arayüzündeki bir lipid tek tabakasına tekrar tekrar daldırılmasıyla ve böylece her geçişte tek bir yaprağın yakalanmasıyla, ~4 µm çapındaki bir cam mikropipet açıklığında asılı, çözücü içermeyen bir lipid çift tabakasının oluşmasını sağlar. Patch-clamp tekniği, lipid çift tabakalarında tek kanal ölçümleri için de kullanılmıştır. Örneğin, punch-out yönteminde7, bir kayıt odasındaki açıklığın üzerine başlangıçta boyanmış geniş bir membranı yamamak için 10 ile 80 µm arasında çapta bir cam pipet kullanılır. Alternatif olarak, lipozom-patch yöntemi, çözücü içermeyen bir BLM8,9 olarak önceden oluşturulmuş nano ile mikro boyutlu bir vezikülün kullanımını içerir. Özellikle, dev unilameller veziküller; hücreye yapışık ve eksize patch modları dahil olmak üzere farklı patch-clamp konfigürasyonları aracılığıyla tek kanal kayıtları için yaygın olarak kullanılmıştır10,11.
Birden fazla çift katmanın paralel ve otomatik olarak oluşturulması için çeşitli platformlar da geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlardan biri, sulu damlacıkların bir lipid-solvent karışımına yerleştirildiği damlacık arayüzü çift katman (DIB) tekniğidir12. Bu yöntemde, lipid tek katmanlar damlacıkların etrafında kendiliğinden birleşir ve iki damlacık temas ettiğinde çift katman oluşumu gerçekleşir. Bazı düzeneklerde, membran stabilitesini artırmak için DIB'ler hidrojeller üzerinde oluşturulabilir13. Bir cam pipet ucunda DIB oluşumuna dayanan alternatif bir yaklaşım ise, iki mikropipet kullanılarak bir yağ fazına sulu kabarcıkların verildiği temas kabarcığı çift katman (CBB) yöntemidir14. DIB yaklaşımında olduğu gibi, lipid kaplı iki kabarcık temas ettirildiğinde kendiliğinden bir lipid çift katman oluşur. Bir diğer platform ise, ızgara deseninde düzenlenmiş, iyi tanımlanmış mikro ile nano ölçekli gözenek dizilerinden oluşan dizili BLM sistemleridir. Bu sistemlerde, askıda lipid çift katmanlar; boyama veya katlama teknikleri ya da lipozom vezikül rüptürü kullanılarak manuel olarak15,16,17 veya mikroakışkan kanal yapılarıyla birleştirildiğinde lipid ve tampon çözeltilerin ardışık enjeksiyonu yoluyla otomatik olarak oluşturulabilir18,19.
Çözücüsüz BLM'ler oluşturmak için birçok yöntem geliştirilmiş olsa da, bu çalışmada, yapay bir lipid çift katmanına gömülmüş membran proteinlerinin tek kanallı davranışını incelemek için minyatürize edilmiş ve entegre bir platformda uygulanan katlama yöntemine odaklanıyoruz. Deneyler, iki bileşenden oluşan Elements düzeneği kullanılarak gerçekleştirilmiştir: Elements Nanopore Reader (eNPR amplifikatörü) ve BLMchipMM (Şekil 2A ve Şekil 2B). İlk cihaz, eksiksiz ve bağımsız bir ünite oluşturarak çalışma alanını sadeleştiren ve ek harici cihazlara olan ihtiyacı ortadan kaldıran kompakt, düşük gürültülü bir voltaj-clamp amplifikatörüdür. BLMchipMM, Montal–Mueller tekniği için tasarlanmış, önceden monte edilmiş ve minyatürize edilmiş bir sistem olup deneysel arayüz görevi görür. Sistem, amplifikatöre doğrudan bağlantı için elektrot görevi gören Ag/AgCl telleri yerleştirmek üzere tasarlanmış iki soketi içeren bir baskılı devre kartı (PCB) ile entegre, şeffaf bir polimetil metakrilat (PMMA) kayıt odasından oluşur. Odanın çekirdek yapısı, iki şeffaf PMMA bileşeni arasında mühürlenmiş bir poliimid septumdan meydana gelir. Septum, çift katman oluşumunu kolaylaştırmak için kalınlığın 25 µm'ye düşürüldüğü küçük bir merkezi bölge (3,78 mm2) hariç 50 µm kalınlığındadır. Bu daha ince bölgenin merkezinde, lazerle delme yoluyla konik bir açıklık oluşturulmuştur ve bu durum lipid çift katmanının mekanik stabilitesini artırır20,21. Membran kapasitansının ayarlanmasına olanak tanıyan dört farklı açıklık çapı (50, 75, 100 ve 140 µm) mevcuttur (Tablo 1). Her bir PMMA bileşeni, elektrolit çözeltisini tutmak için poliimid septumun her iki yanında iki akışkan bölme oluşturan 110 µL hacminde C şeklinde bir boşluğa sahiptir. Her bir PMMA bloğunun zıt taraflarına iki eğimli akışkan kanal delinmiştir: kanallardan biri Ag/AgCl elektrodunu yerleştirmek için kullanılırken, diğeri pipetleme yoluyla rezervuardaki tampon seviyesinin manuel olarak ayarlanmasına olanak tanır.
<img alt="Modüler bölmeli mikroakışkan cihaz; şema PMMA tarafını, elektrotları ve analiz için PCB'yi göstermektedir." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2: Entegre Elements Nanopore Reader ve BLMchipMM sistemi. (A) BLMchipMM'nin Elements Nanopore Reader (eNPR) amplifikatörünün özel yuvasına yerleştirilmiş halini gösteren fotoğraf. (B) Polimetil metakrilat (PMMA) kayıt odası, mikro boyutlu açıklığı içeren poliimid septum ve Ag/AgCl elektrotlar için soketler ile oda hizalaması için bir yuva içeren baskılı devre kartı (PCB) dahil olmak üzere BLMchipMM bileşenlerinin şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Delik çapı (µm)</td>
			<td >50</td>
			<td >75</td>
			<td >100</td>
			<td >140</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Delik kalınlığı (µm)</td>
			<td >25</td>
			<td >25</td>
			<td >25</td>
			<td >25</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tipik membran kapasitansı (pF)</td>
			<td >20–40</td>
			<td >40–60</td>
			<td >60–90</td>
			<td >90–140</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tablo 1: Mevcut BLMchipMM açıklık formatlarının özellikleri. 50, 75, 100 ve 140 µm açıklıklara sahip BLMchipMM cihazları için delik çapı, açıklık bölgesindeki septum kalınlığı ve tipik membran kapasitans değerleri. Membran kapasitans değerleri, 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine lipidlerinden oluşturulan çift katmanlar için gösterilmiştir.
Laboratuvarlarda kullanılan kayıt odaları genellikle ya el yapımı üniteler ya da ticari olarak mevcut olan cihazlardır. İlk durumda, sistemin inşası çeşitli bileşenlerin birleştirilmesini ve septumdaki açıklığı oluşturmak için güvenilir bir yöntemin geliştirilmesini gerektirir, bu da birçok laboratuvar için erişilebilirliği kısıtlayabilir. Ticari cihazlar kullanıldığında bile, bunlar genellikle her deneyden önce birden fazla bileşenin manuel olarak entegre edilmesini gerektirir. Buna karşılık, BLMchipMM önceden monte edilmiştir ve rutin temizleme prosedürleri için deneyler arasında sökülme gerektirmez. Kullanılan çözücülerin cihaz malzemeleriyle uyumlu olması şartıyla, aynı ünite membran oluşum kalitesinden ödün vermeden yıkanabilir ve birden fazla deney için yeniden kullanılabilir. Bu durum, kullanıcıya bağlı değişkenliği azaltır ve manuel sızdırmazlık elemanlarıyla ilişkili sızıntı riskini minimize eder. Harici, değiştirilebilir ve yenilenebilir gümüş tel elektrotların kullanımı, özellikle elektrot tüketimini hızlandıran deneysel koşullar altında sistemin kullanılabilir ömrünü daha da uzatır.
Dahası, ev yapımı düzenekler genellikle büyük bölme hacimlerine sahiptir ve bu durum deneyler için gereken biyolojik ve kimyasal bileşen miktarını artırır. Buna karşılık, BLMchipMM'nin minyatürizasyonu, deneysel hacimlerin minimize edilmesine olanak tanıyarak reaktiflerin, proteinlerin ve diğer bileşiklerin tüketimini önemli ölçüde azaltır. Bu durum, özellikle ekspresyonu zor veya düşük verimli membran proteinleriyle çalışırken veya test bileşiklerinin sentez maliyetinin yüksek olduğu ve deneylerin toplam maliyetini artırdığı durumlarda oldukça avantajlıdır. Önemli bir nokta olarak BLMchipMM, solventi minimize edilmiş çift katmanların oluşumunu sağlar ve her bir yaprağın farklı lipid türlerinden oluşabildiği asimetrik membran konfigürasyonlarını destekleyerek5,22, membran protein fonksiyonunun kontrollü koşullar altında incelenmesini kolaylaştırır.
Geleneksel olarak akım ölçümleri, genellikle veri toplama için ayrı bir dijitalleştiriciye bağlanmayı ve grafik arayüzler üzerinden kontrol edilmeyi gerektiren, patch-clamp deneyleri için tasarlanmış amplifikatörler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu sistemler sadece hantal ve pahalı olmakla kalmaz, aynı zamanda uzman olmayan kullanıcılar için genellikle sezgisel olmayan kurulum prosedürleri içerir. Ek olarak, kayıt odasının boyutu ve standart amplifikatörlerin tasarımı nedeniyle —ki bunlar genellikle baş aşaması girişini elektrostatik parazitlerden korumak için yerleşik bir zırha sahip değildir— harici bir Faraday kafesinin kullanımı sıklıkla gereklidir. Böyle bir kafesin kalitesi ve topraklaması, sistemin gürültü performansını önemli ölçüde etkileyebilir. BLMchipMM, kompakt entegre bir amplifikatör ile kullanıldığında, harici bileşenlere olan ihtiyacı azaltarak bu konfigürasyonu basitleştirir. Sinyal dijitalleştirme işlemleri cihazın içinde gerçekleşir ve sistem gövdesi, ortamdaki elektromanyetik parazitlere karşı duyarlılığı azaltan bir zırhlama sağlar.
Bu platformun uygulanabilirliğini göstermek için, TREK alt ailesinin bilgisayar ortamında türetilmiş atasal bir üyesi olan K2P benzeri kanal ancTREK1 (Ek Şekil 1), başarılı rekonstitüsyonu ve tek kanal kaydını doğrulamak amacıyla test proteini olarak kullanılmıştır. K2P kanalları, dinlenme membran potansiyelini ve hücresel eksitabiliteyi düzenleyen dimerik potasyum sızıntı kanalları oluşturur ve TREK kanalları iyi karakterize edilmiş bir alt familyayı temsil eder.

<table><tbody><tr><td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Yapay lipid çift tabakalarının oluşturulması</td></tr><tr><td>2-Propanol (&amp;ge;99.5%)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>BLMchipMM cihazının temizlenmesi</td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Agaroz jellerin hazırlanması</td></tr><tr><td>Agaroz jel yatay elektroforez sistemi</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>DNA fragmanlarının ayrılması</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>Transforme edilmiş bakterilerin seçimi</td></tr><tr><td>Anti-GFP nanobody Sepharose reçinesi (ev yapımı)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>GFP etiketli proteinlerin afinite saflaştırılması</td></tr><tr><td>Anza Alkalin Fosfataz</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>Vektör defosforilasyonu</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>Restriksiyon sindirimi</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>Restriksiyon sindirimi</td></tr><tr><td>Anza Red Buffer (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>Restriksiyon sindirim tamponu</td></tr><tr><td>Aprotinin proteaz inhibitörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>Protein degradasyonunun önlenmesi</td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>Hücre çöktürme ve numune hazırlama</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Planar lipid çift tabakalarının oluşturulması</td></tr><tr><td>Kolesteril hemisuksinat (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>Membran proteinlerinin stabilizasyonu</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>Protein boyama</td></tr><tr><td>Sıradan ev tipi çamaşır suyu</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Ag tellerin klorlanması</td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Lizat viskozitesinin azaltılması</td></tr><tr><td>Çift distile su</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Tamponların ve çözeltilerin hazırlanması</td></tr><tr><td>Etanol (saf, 99.9%)</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Ag/AgCl tellerin temizlenmesi</td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>DNA boyama</td></tr><tr><td>Ekstra ince kumlu zımpara kağıdı</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Tellerden Ag/AgCl kaplamanın uzaklaştırılması</td></tr><tr><td>eNPR 100 kHz amplifikatör</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Elektrofizyolojik kayıtlar</td></tr><tr><td>Agarozdan DNA ekstraksiyonu için Gel-Out kiti</td><td>A&amp;amp;A Biotechnology</td><td>023-250</td><td>DNA saflaştırma</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA merdiveni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA boyut referansı</td></tr><tr><td>FreeStyle&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>ancTREK1 protein ekspresyonu</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99.5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Tamponlama ajanı</td></tr><tr><td>Heksadekan (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>Açıklık ön işlemi</td></tr><tr><td>Heksan (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>Lipid çözücü</td></tr><tr><td>Ev yapımı 5&amp;times; DNA yükleme boyası</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>DNA numune hazırlama</td></tr><tr><td>Ev yapımı 6&amp;times; Laemmli SDS tamponu (indirgeyici)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Protein numune hazırlama</td></tr><tr><td>Ev yapımı boya giderme çözeltisi</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>SDS-PAGE jellerinin boyasının giderilmesi</td></tr><tr><td>Ev yapımı HRV-3C proteaz</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Füzyon proteinlerin kesilmesi</td></tr><tr><td>Ev yapımı SDS-PAGE yürütme tamponu (10&amp;times;)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>SDS-PAGE elektroforez tamponu</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>His etiketli proteinlerin elüsyonu</td></tr><tr><td>Seri içi (in-batch) saflaştırma kolonları</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Protein saflaştırma iş akışları</td></tr><tr><td>Innova44 çalkalamalı inkübatör</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>Hücre kültürü büyümesi</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>Elektrolit ve tampon hazırlama</td></tr><tr><td>LB besiyeri (Lennox)</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>Bakteriyel kültür</td></tr><tr><td>Leupeptin proteaz inhibitörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>Protein degradasyonunun önlenmesi</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>Tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Nanodrop spektrofotometre</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>DNA ve protein kantifikasyonu</td></tr><tr><td>n-Dodesil-&amp;beta;-D-maltosit (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>Membran proteini solubilizasyonu</td></tr><tr><td>Ni Sepharose High Performance Reçinesi</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>IMAC saflaştırma</td></tr><tr><td>Dizüstü bilgisayar</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Cihaz kontrolü ve veri toplama</td></tr><tr><td>Optima LE-80K ultrasantrifüj</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>Membran fraksiyonu izolasyonu</td></tr><tr><td>Pentan (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>Lipid çözücü</td></tr><tr><td>Pepstatin A proteaz inhibitörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>Protein degradasyonunun önlenmesi</td></tr><tr><td>Phusion GC Tamponu (5&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>PCR tamponu</td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>PCR amplifikasyonu</td></tr><tr><td>PMSF proteaz inhibitörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Lizis sırasında protein koruması</td></tr><tr><td>Polietilenimin (PEI)</td><td>Clinisciences</td><td>24765-100</td><td>Transfeksiyon ajanı</td></tr><tr><td>ProteinEle hazır dökülmüş Tris-glisin jel (4&amp;ndash;20%)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>Protein ayrımı</td></tr><tr><td>SDS-PAGE jel elektroforez sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>Protein elektroforezi</td></tr><tr><td>Sodyum bütirat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>Protein ekspresyonu artırıcı</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>DNA ligasyonu</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz tamponu (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>Ligasyon tamponu</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici (Mastercycler Nexus)</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>PCR amplifikasyonu</td></tr><tr><td>Tris baz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>Tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Lesitin ve polisorbate 80 içeren Tripton SOYA agar</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>Bakteriyel ekim</td></tr><tr><td>İki adet Ag tel</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Elektrofizyoloji için elektrotlar</td></tr><tr><td>Ultra-spin konsantratör (50 kDa kesme sınırı)</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>Protein konsantrasyonu</td></tr><tr><td>pEG BacMam ekspresyon vektörü</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>Protein ekspresyonu</td></tr><tr><td>USB kablosu</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Amplifikatör ve bilgisayar arasındaki bağlantı</td></tr></tbody></table>

sentetik bir k2p kanalının kaydı için minyatürize edilmiş montal–mueller planar lipid Çift tabakası sistemi kullanılarak tek kanallı elektrofizyoloji

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

İyon kanallarının düzlemsel lipid çift tabakalara fonksiyonel rekonstitüsyonu, kanal aktivitesinin tek molekül düzeyinde incelenmesi için bir strateji sağlar. Ancak, geleneksel Montal–Mueller çift tabaka sistemleri genellikle hantal deneysel düzenekler, manuel hazne kurulumu ve nispeten büyük kayıt hacimleri gerektirir; bu durum reaktif tüketimini artırır ve uzatılmış kablolama ile harici kafa katları nedeniyle ek elektriksel gürültü kaynaklarına yol açabilir. Burada, azaltılmış reaktif tüketimi ve basitleştirilmiş operasyon ile stabil tek kanal kayıtlarına olanak tanıyan, kompakt bir amplifikatör ile entegre edilmiş minyatürize, kullanıma hazır bir çift tabaka platformu (BLMchipMM) sunuyoruz. Bu protokol, tek kanal elektrofizyoloji ölçümleri gerçekleştirmek için bu sistemin kullanımını açıklamaktadır. Bu sistemi kullanarak, sentetik bir K2P kanalını (ancTREK1) rekonstitüe ettik ve bunu rekonstitüsyon ile tek kanal kaydını doğrulamak için bir prensip kanıtlama test proteini olarak kullandık. Tek kanal kayıtları, Mg2+-içermeyen simetrik K+ çözeltilerinde, TREK1 kanalları için rapor edilenlerle tutarlı iletkenlik değerlerine sahip bir akım-gerilim ilişkisi göstermektedir. Bu K2P-benzeri kanalın başarılı rekonstitüsyonu, sistemin yapay membranlarda tek kanal analizi için faydasını kanıtlamaktadır.

PLB membranlarının akım-gerilim (I–V) karakteristikleri
Çift katmanlı membranların doğal hidrofobik yapısı, yüklü türlerin geçişine izin vermez. Ancak, dış bir elektrik alanının uygulanması, nanometre boyutunda geçici gözeneklerin oluşumunu tetikleyerek membran geçirgenliğini ve iletkenliğini etkileyebilir33. 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine lipidlerinden oluşturulan yapay çift katmanların kalitesini değerlendirmek amacıyla; protein eklenmemiş durumda membran kapasitansı, direnci ve I–V karakteristikleri incelenmiştir. ±20 ile ±200 mV arasında (±20 mV artışlarla) bir dizi voltaj basamağı uygulanmış ve buna bağlı oluşan transmembran akımları kaydedilmiştir. Veriler 5 kHz hızında örneklenmiş ve 2,5 kHz düşük geçiren filtre ile filtrelenmiştir.
Membran kapasitansı (Cm) ve membran direnci (Rm), çift katman kalitesini değerlendirmek için temel parametreleri temsil eder. PLB, membranın bir dirençle paralel bir kapasitör gibi davrandığı eşdeğer bir direnç-kapasitör (RC) devresi ile tanımlanabilir34. Kapasitif bileşen membranın yük depolama yeteneğini yansıtırken, direnç bileşeni iyon geçirgenliğini yansıtır. Üçgen şeklinde bir voltaj dalga formunun uygulanması, şu formüle göre membran kapasitansı ile orantılı olan kare şeklinde bir kapasitif akım yanıtı oluşturur:
<img alt="Kapasitif akım formülü I_c=C_m(dv/dt) denklemi, elektrik devresi analizini göstermektedir." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Denklem 1">    (1)
Burada, Cm membran kapasitansını, V uygulanan voltajı ve t zamanı temsil eder. Membran oluşumunu takiben, çift katmanın kademeli olarak incelmesi nedeniyle kapasitans değerleri zamanla artabilir35. Membran paralel plakalı bir kapasitör olarak düşünüldüğünde, kapasitans membran alanı ve kalınlığı ile şu şekilde ilişkilidir:
<img alt="Lipidlerle kapasite formülü, denklem, eğitim diyagramı, dielektrik sabiti." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Denklem 2">    (2)
Burada, εlipids lipid çekirdeğinin dielektrik sabiti (~2), ε0 boşluğun geçirgenliği, A membran alanı ve d membran kalınlığıdır36,37.
Membran direnci, Ohm kanunu kullanılarak belirlenmiştir33:
<img alt="Elektromotor kuvvet denklemi Ir=V/Rm formülü, elektriksel direnç için eğitim diyagramı." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Denklem 3">    (3)
Burada, V uygulanan voltajı ve Rm membran direncini temsil eder. İyon kanallarının yokluğunda, membran akımı 0 pA civarında kalır ve bu durum giga-ohm (GΩ) aralığındaki direnç değerlerine karşılık gelir33.
75 ve 100 µm açıklıklı BLMchipMM cihazları için I–V ilişkisi, 0 ile ±200 mV arasında lineer (ohmik) davranış sergilemiştir. Verilerin lineer fitlenmesi sonucunda, 75 µm açıklık için 847 ± 16 GΩ (n = 6) (Şekil 8A, daireler) ve 100 µm açıklık için 980 ± 32 GΩ (n = 7) (Şekil 8A, kareler) membran direnç değerleri elde edilmiştir. Akım izinin 3 s'lik bölümleri üzerinden ölçülen RMS gürültü değerleri, 100 µm açıklık için 3,1 ± 2 pA (n = 7) ve 75 µm açıklık için 2,6 ± 0,1 pA (n = 6) olarak belirlenmiştir. Membran stabilitesi, toplam 1 h'lik süre boyunca yaklaşık 2 dk aralıklarla direncin ölçülmesiyle değerlendirilmiştir (Şekil 8B). İyi oluşmuş membranlar tutarlı bir şekilde 1 h'den fazla stabil kalmıştır; bu süre çoğu elektrofizyolojik deney için yeterlidir. Membranlar genellikle ±200 mV'ye kadar uygulanan potansiyelleri instabilite belirtisi göstermeden tolere etmiş, ancak tekil bilayer'a bağlı olarak ±220 ile ±300 mV arasında breakdown gerçekleşmiştir. 75 µm açıklıklar için 40 ile 60 pF, 100 µm açıklıklar için 60 ile 90 pF arasında kapasitans değerlerine ve 100 mV'de ≤0,5 pA akım değerlerine sahip olan membranlar protein insersiyonu için uygun kabul edilmiştir.
<img alt="Gerilim-akım ve direnç-zaman grafikleri, çift katmanlı membran çip çalışması, veri analiz sonuçları." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Şekil 8"> 
Şekil 8: PLB'lerin elektriksel karakterizasyonu. (A) 75 µm ve 100 µm açıklıklarda oluşturulan çift katmanlarınle akım-gerilim (I–V) ilişkileri, ±200 mV arasında lineer (omik) davranış sergilemektedir. Lineer regresyon, sırasıyla 847 ± 16 GΩ (n = 6) ve 980 ± 32 GΩ (n = 7) membran direnç değerleri vermektedir. (B) Membran stabilitesi, direncin 1 sa boyunca 2 dk aralıklarla izlenmesiyle değerlendirilmiştir. Membranlar ±200 mV'ye kadar stabil kalmakta ve ±220 ile ±300 mV arasındaki gerilimlerde yırtılmaktadır. Veriler, ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak sunulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
ancTREK1 tek kanal davranışının başlangıç karakterizasyonu
Sentetik ancTREK1 saflaştırılmış ve PLB'ler içine yeniden konstrükt edilmiş; tek kanal aktivitesi, −120 ile 120 mV arasında 20 mV artışlarla uygulanan voltaj basamak protokolleri kullanılarak izlenmiştir. Tek kanal kayıtları (Şekil 9A ve Şekil 9B), K2P kanallarının karakteristik titreme davranışını ortaya koymuştur38. 80 mV'de ortalama akım genliği 13,02 ± 0,78 pA (n = 5) iken, −80 mV'de akım genliği −18,72 ± 0,25 pA'e (n = 5) yükselmiştir (Şekil 9C). Ortaya çıkan I–V ilişkisi, Mg2+-içermeyen simetrik 200 mM potasyum koşulları altında hem pozitif hem de negatif potansiyellerde ölçülebilir tek kanal akımlarının olduğunu göstermiştir (Şekil 9D). Akım genlikleri 5 kHz hızında edinilen ve 2,5 kHz düşük geçiren filtre ile filtrelenen kayıtların tüm nokta histogramlarından tahmin edildiği için, bu I–V ilişkisi kapsamlı bir biyofiziksel karakterizasyondan ziyade tanımlayıcı bir prensip kanıtı olarak sunulmuştur.
<img alt="İyon kanalı aktivite analizi; +80mV ve -80mV'deki akım izleri ve genlik histogramları grafiği." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 9"> 
Şekil 9: Sentetik ancTREK1'in tek kanal aktivitesi. (A ve B) Sırasıyla 80 mV ve −80 mV'de kaydedilen temsili tek kanal akım izleri. Kesikli çizgiler kapalı kanal seviyesini belirtir. (C) Pozitif (sol) ve negatif (sağ) potansiyeller için tüm nokta genlik histogramları. (D) Divalan katyonlar olmaksızın simetrik 200 mM potasyum (K+) koşulları altında ancTREK1'in I–V ilişkisi. Eğri dördüncü derece bir polinom kullanılarak uydurulmuştur ve iletkenlik değerleri ±80 mV'deki eğimden türetilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
ancTREK1, memeli TREK1 kanallarına kıyasla genişletilmiş N- ve C-terminal bölgelerden yoksun olsa da, yeniden yapılandırıldığında fonksiyonel olarak aktif kalmıştır. Pozitif potansiyellerde yüksek ve düşük iletkenlik modları (sırasıyla 132 ± 5 pS ve 41 ± 5 pS) sergileyen memeli TREK1'in39 aksine, ancTREK1 yalnızca yüksek iletkenlik modu göstermiştir. Pozitif potansiyellerdeki tek kanal iletkenliği 112.8 ± 10.8 pS (80 mV, n = 5) olarak belirlenmiş olup, bu değer TREK kanalları için rapor edilen değerlerle (simetrik potasyum koşulları altında 85–130 pS) uyumludur38,39,40,41. Negatif potansiyellerde iletkenlik, daha önce rapor edilen TREK1 davranımıyla uyumlu olarak 205.6 ± 2.05 pS'ye (−80 mV, n = 5) yükselmiştir39. Özellikle ancTREK1, eksize patch konfigürasyonları kullanılarak elde edilen TREK1 ölçümlerine kıyasla daha yüksek bir normalize açık olasılığı (NPo) sergilemiştir42. NPo–voltaj ilişkisi, pozitif potansiyellerde artan kanal aktivitesi göstermiş ve 80 mV'de 0.78 ± 0.02'ye (n = 5) ulaşmıştır. Buna karşılık NPo, negatif potansiyellerde azalmış; −80 mV'de 0.53 ± 0.04 ve −120 mV'de 0.28 ± 0.03 değerleri almıştır (Şekil 10).
<img alt="İyon kanalı elektrofizyolojisi sonuçları, NPo'ya karşı voltaj (mV) grafiği, sütun grafiği karşılaştırması, veri analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Şekil 10"> 
Şekil 10: ancTREK1 tek kanal aktivitesinin voltaja bağımlılık analizi. Membran potansiyelinin bir fonksiyonu olarak normalize edilmiş açık olasılığı (NPo) (sol) ve 80 mV ile −80 mV'deki NPo'nun karşılaştırması (sağ); pozitif potansiyellerde artmış kanal açılmasını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1. Sentetik atasal iki gözenekli domain potasyum (K2P) kanalının (ancTREK1) amino asit dizisi. Elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılan ancTREK1'in tam uzunluktaki amino asit dizisi. Dizi; UniProt ve NCBI veri tabanlarından toplanan ortolog diziler dahil olmak üzere, TREK/TRAAK familyası üyelerinden oluşan küratörlü bir veri setinden atasal dizi çıkarımıyla, korunan gözenek motiflerine göre filtrelenerek, hizalanarak ve maksimum olabilirlik filogenetiği kullanılarak analiz edilmek suretiyle yeniden oluşturulmuştur.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, kararlı tek kanal kayıtları gerçekleştirmek için entegre amplifikasyona sahip minyatürleştirilmiş bir Montal–Mueller düzlemsel lipid çift katman sisteminin kullanımını açıklamaktadır. Yöntem, sistem performansını doğrulamak amacıyla saflaştırılmış sentetik bir K2P kanalının yeniden konstitüe edilmesiyle gösterilmiştir.

Sentetik bir K2P Kanalının Kaydı için Minyatürize Edilmiş Montal–Mueller Planar Lipid Çift Tabakası Sistemi Kullanılarak Tek Kanallı Elektrofizyoloji

İyon kanallarının düzlemsel lipid çift katmanlarına fonksiyonel olarak yeniden yapılandırılması, kanal aktivitesini tek molekül düzeyinde incelemek için bir strateji sağlar. ...

Araştırmamız, entegre yapısal biyoloji ve elektrofizyolojik teknikler kullanarak iyon kanallarının ve taşıyıcıların nasıl çalıştığını anlamaya odaklanmaktadır. Geleneksel çift katmanlı düzenekler karmaşık enstrümantasyon ve manuel montaj gerektirirken, bu sistem kompakt bir amplifikatörü entegre eden minyatürleştirilmiş, kullanıma hazır bir platformdur.Başlamak için, cihaz kalibrasyonunu gerçekleştirerek ve gümüş veya gümüş klorür elektrotlarını hazırlayarak elektrofizyoloji düzeneğini hazırlayın. İki gümüş telin klorlanmamış uçlarını baskılı devre kartı veya PCB soketlerine yerleştirin. Tellerin klorlanmış uçlarını polimetilmetakrilat veya PMMA bileşeninde delinmiş olan akışkan kanallarına yerleştirin. Siyah lipid membran çipini veya BLMchipMM'yi nazikçe döndürün ve PMMA kayıt odasının alt dişini özel yuvasına oturtarak PCB üzerine monte edin. Telin akışkan kanallarının sonuna ulaştığından emin olun. Septum açıklığı ön işlemi için %100 n-hekzan içerisinde hacimce %1'lik heksadekan çözeltisinden 100 µL hazırlayın. 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine veya DPhPC lipidlerini %100 n-pentan içerisinde 15 mg/mL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde yeniden süspande edin. 3 mL 1 M

single-channel-electrophysiology-using-miniaturized-montalmueller

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video su kaplan semender retina dilim tam hücreli gerilim kelepçe kayıtları süreci gösterir. Biz yanı sıra retinanın görsel uyarılma sırasında yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için nasıl dilim hazırlık göstermektedir.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

Membran protein fonksiyonu, hücre zarı lipid bileşimi tarafından düzenlenir. Bu video-makale nasıl değişmiş membran özellikleri gazetecilere olarak çift katlı yama elektrotlar, hem de nasıl kullanılacağı gibi gramicidin kanallarını kullanarak bir yama oluşturmak için ayrıntıları.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Düzlemsel çift katlı lipit katmanını da adlandırılan yapay çift katlı lipit katmanını, çalışma izin iyon iletken, iyi tanımlanmış bir ortamda kanal. Burada, bilayeri odası hazırlamak için gerekli bireysel adımlar, elektrotlar ve nasıl bilayeri tek kanal ölçümleri için uygun olup olmadığını test etmek için ortaya koymaktadır.

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Bu videoda, nörona özgü floresan proteinler içeren transgenik beyin dilimlerinden elektriksel aktivitenin aynı anda görüntülenmesi ve kaydedilmesi için bir yöntem özetlenmektedir. Prosedür, beyin diliminin havalandırılmış yapay beyin omurilik sıvısı ile bir perfüzyon odasında tutulmasını, floresan etiketli hücreleri uyarmak için bir ışık kaynağı kullanılmasını ve elektrik sinyallerinin çok kanallı bir prob ve yama kelepçesi ile kaydedilmesini içerir.

Beyin Dilimlerindeki Nöronal Hücrelerin Eş Zamanlı Optik ve Elektrofizyolojik İzlenmesi

Kv kanal disfonksiyonu kardiyak aritmiler ile ilişkilidir. Biz Kv kanal yan altbirim knockout farelerde atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu için sistematik bir protokol kullanmak gibi aritmiler neden moleküler mekanizmaları incelemek için. İzole kardiyomiyositlerde hemen sonra hücresel elektrofizyolojik çalışmalar, biyokimyasal ya da immunofloresan (IF) deneyleri için de kullanılabilir.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Presinaptik salım yüz zarında Ca2+ akımlarının kaydedilmesi, Ca2+ girişinin ve nörotransmitter salınımının kesin olarak anlaşılmasının anahtarıdır. Fonksiyonel izole retikülospinal aksonlar veren lamprey omuriliğinin akut bir ayrışmasını sunuyoruz ve bu da bireysel presinaptik terminallerin serbest bırakma yüz zarından doğrudan kayda izin veriyor.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Kapalı döngü protokolleri günümüz elektrofizyolojisinde giderek yaygınlaşmaktadır. Kortikal piramidal nöronlarda in vitro olarak karmaşık elektrofizyolojik protokolleri gerçekleştirmenin basit, çok yönlü ve ucuz bir yolunu sunuyoruz.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini katkıda bulunmak ve ekstraselüler K+ konsantrasyon hücresel uyarılabilirlik çok önemli bir düzenleyicisidir. Biz nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Böyle elektrotları kullanarak elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics yetişkin Hipokampal dilimleri içinde ölçüm sağlar.

Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Öğrenin, miniaturize Montal–Mueller planar lipid çift tabaka sistemi kullanarak tek kanallı elektrofizyoloji yöntemiyle sentetik K₂P iyon kanallarının fonksiyonel rekonstitüsyonunu ve kaydını nasıl gerçekleştireceğinizi.

Sentetik bir K2P Kanalının Kaydı için Minyatürize Edilmiş Montal–Mueller Planar Lipid Çift Tabakası Sistemi Kullanılarak Tek Kanallı Elektrofizyoloji (Video) | JoVE Journal

Sentetik bir K_2P Kanalının Kaydı için Minyatürize Edilmiş Montal–Mueller Planar Lipid Çift Tabakası Sistemi Kullanılarak Tek Kanallı Elektrofizyoloji

Daha fazla video keşfet