Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Araştırmamız, septat bağlantı proteinlerinin gelişimsel nonokkluding fonksiyonlarını incelemekte, yapı ve biyolojik rollerde yer alan yeni bileşenleri tanımlama ve karakterize etmeye odaklanmaktadır. Bu protokol, Drosophila embriyolarının ektodermal epitelisindeki pile septat bağlantılarının organizasyonunu ve kapatma fonksiyonunu karakterize etmek için tasarlanmıştır. Başlangıç olarak, uygun genotiplere sahip sağlıklı erkek ve dişi Drosophila sineklerini çaprazlayın ve onları embriyo toplama kafeslerine taze elma suyu tabaklarıyla maya macunu sürtülerek yerleştirin.

Yetişkinlerin döllenmiş yumurtaları elma suyu tabaklarına bırakmasına izin verin. Yumurta toplama kafesinden plakayı çıkarın ve embriyoları yumurta bıraktıktan sonra 25 derece Celsius'ta 13 ila 16 saat yaşlandırılarak 16. aşamaya ulaşın. Daha sonra 16. aşama embriyoları uygun fiksatif çözeltiye sabitleyin ve istenen antikorlarla immünboyama işlemi yapıldı.

En iyi sonuçlar için embriyoları 40x yağ daldırma objektif olan konfokal mikroskopta görüntüleyin. İlgilenen embriyoya odaklandıktan sonra, lazer yoğunluğu ve kazancını ayarlayarak pikselleri aşırı doygunlaştırmadan güçlü bir floresan sinyal elde edin. Dengeleyici kodlu yeşil floresan proteini ifade etmeyen 16. evre embriyoları, midgut morfolojisini kullanarak tanımlayın.

Taramayı tükürük bezine veya arka bağırsağa odaklayın ve Z-taramasını lümenin mümkün olan en büyük çapını kapsayacak şekilde konumlandırarak epitel hücresinin tam yan zarını görselleştirin. Uygun bir çizgi ortalaması belirleyin ve en az 20 kontrol ve 20 Cora 4 mutant 16. evre embriyoda polarize bir doku görüntüleyin. Veri kaydedilmesi, sadece yapışma birleşim belirteci zarın apikal-lateral bölgesine sıkı lokalize olduğu embriyolardan alın.

Vahşi tip 16. evre embriyolarda, yanel zarın apikal bölgesi boyunca pliseli septat birleşim proteinlerinin zenginleşmesini değerlendirin. Mutantın yan zar boyunca pliseli septat birleşim belirtecinin kalıcı dağılımını kaydedin. Rodamin etiketli 10 kilodalton dekstranı mililitrede 1 miligram pH 7.5 içinde 0.5 mol sodyum fosfatta ve 5 milimolar potasyum klorür ile çözerek yeni bir boya çözeltisi oluşturun.

İğne çekicisi kullanarak, 1 milimetrelik dış çaplı ve 0,5 milimetre iç çaplı kapiler tüpü lifli bir cam iğneye çekilin. Sonra, cam iğneyi mikromanipülatör üzerindeki iğne tutucusuna yükleyin ve mikromanipülatörü ters bir mikroskobin yanına yerleştirin. İğneyi mikroskop slaytına mümkün olduğunca paralel konumlandırın ve slaytın yanındaki aynı Z-düzlemine indirin.

İğnenin ucunu mikroskop slaydının yanına vurarak kırın. İğneyi sürgü seviyesinin üzerine kaldırın ve yükleme için çıkarın. Sonra, en küçük pipet ucu kullanarak kapiller tüpünü boya ile doldurun.

Doldurulan iğneyi iğne tutucuya yeniden doldurun. 10 kilodaltonluk dekstranın akışını, mikroskop slaytı yüzeyindeki halokarbon yağı damlasına az miktarda enjekte ederek test edin. 22 x 22 milimetre kalınlığında 2 kalınlığında bir kapak kullanarak, elma suyu tabağı üzerinde girintili bir çizgi oluşturun.

Elma suyu tabağında yaklaşık 25 embriyoyu kontrol ve Cora 4 mutantı 16 veya 17. aşamada dizin. Arka uçlarının çizgi boyunca hizalandığından ve ventral yüzeylerin yukarıya baktığından emin olun. Sonra 22 x 22 milimetre 2 numaralı kapak parçasına çift taraflı bir bant yapıştırın.

Bandı embriyo çizgisine dokundurun ve kapak parçasını hafifçe ovarak embriyoları plakadan çift taraflı banda aktarın. Sonra, bir mikroskop slaytına bir damla halokarbon yağı ekleyin ve kapağal hareketiyle bağlanarak kapıl tabakayı sürgüye takın. Kapak kayışını, buzlu herhangi bir kısmın karşısındaki kaydırağın yanına daha yakın yönlendirin.

Embriyoları bir kurutucu kapta üç ila beş dakika boyunca kurutma ve embriyoları tamamen halokarbon yağı ile kaplayın. Embriyolarla birlikte kaydırı, embriyolar yukarı ve hedeften uzakta olacak şekilde ters mikroskopa monte edin. Mikromanipülatörü, iğnenin embriyoların arka ucuna mümkün olduğunca paralel bir açıyla bakacak şekilde hizalaması ve mikromanipülatörün Z eksenini iğne ucunun embriyonun dorsal-ventral ekseni boyunca orta noktasıyla hizalamasında ayarlamasını sağla.

Sonra, aşamayı hızla iğneye taşıyarak embriyoları enjekte ederek iğne ucu hemokoelin içine girer. 10-25 veya 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak yaklaşık 0,2 ila 0,5 nanolitre boya enjekte edin. İğneyi hızla çekin ve boya enjeksiyonu için bir sonraki embriyoya ilerletin.

Sonra embriyoların üzerine ekstra halokarbon yağı ekleyin. Embriyoları, örtük slipleri arasında eşit bir yağ tabakası oluşturmak ve ezilmeyi önlemek için 22 x 22 milimetrelik 2 numaralı bir kapak kayağı ile örtün. Dekstran boya enjeksiyonundan sonra floresan bileşik mikroskop veya konfokal mikroskopla görüntüleme yapın.

Konfokal mikroskopta, dorsal-ventral eksen boyunca embriyo derinliğinin yaklaşık dörtte biri boyunca bir Z-yığını alınarak trakeanın lümenini değerlendirin. Trakea, tükürük bezi veya arka bağırsak lümenini işaretli dekstran birikimi için inceleyin. Her embriyonun genotipini ve gelişim evresini kaydedin ve etiketlenmiş deksranın herhangi bir tübüler organda birikip birikmediğini kaydedin.

Perivitellin boşluğunun boya ile güçlü şekilde boyandığı embriyolara dikkat edin; çünkü bunlar o boşluğa kazarsız enjeksiyonu temsil edebilir. Vahşi tip embriyolarda, makroglobulin komplementle ilişkili (Mcr), 13. evrede lateral membran boyunca eşit şekilde lokalize olmuş, 14. evrede lateral membranın apikal bölgesinde zenginleşmiş ve 16. aşamada apikal-lateral bölgeye, aderen birleşimine bazal olarak güçlü şekilde lokalize olmuştur. Kortikal antikor boyama, evre 16 vahşi tip embriyolarda Mcr'e benzer şekilde olgun pileli septat birleşimlerini tanımlamıştır.

Cora 4 mutant embriyolarında, Mcr 16. aşamada güçlü apikal lokalizasyon elde edemedi ve lateral membran boyunca dağınık kaldı. E-kadherin lokalizasyonu, vahşi tip ve Cora 4 mutant 16. evre embriyolarda benzerdi. Vahşi tip 17. evre embriyolarda rodamin etiketli 10 kilodalton dekstran enjekte edildiğinde, boya trakeayı çevreledi ancak lümeni delmedi.

Cora 4 mutant 17. evre embriyolarında, boya enjeksiyondan sonraki 10 dakika içinde trakea lümeninde birikir. Bu protokol, araştırmacıların Drosophila embriyonik dokularındaki pileli septat birleşimlerinin çekirdek mi aksesuar bileşenini bir genin kodlayıp kodlamadığını güvenle belirlemelerini sağlar. Bu tekniği uygularken embriyo aşaması kesinlikle çok önemlidir, çünkü bunun için 16. aşama embriyolar gereklidir.

Septat birleşimleri zamanla olgunlaşır ve 16. aşamada tam olarak yerleşir. Bu protokolün, RNA girişim hatları kullanılarak yeni pileli septat bağlantı genlerini tanımlamak için açık uçlu genetik taramada etkili şekilde uygulanabileceğine inanıyoruz.