Davranışsal Deneye Dayalı Zebrafish Larvalarında MPTP Kaynaklı Parkinson Benzeri Davranışsal Fenotiplerin Fenotipik Profillenmesi

Larva Zebrafish'te motor ve motor olmayan Parkinson fenotiplerini kapsamlı şekilde profillemek için Multiparametrik bir davranış protokolü sunuyoruz. Bu protokol, Parkinson hastalığı modellemesi, ilaç taraması, çevresel nörotoksisite ve balık larvaları kullanılarak yapılan çalışmalar için geçerlidir. Başlamak için, eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.

100x E3 stok çözeltiyi bir'e 100 oranında ultrasaf suyla seyreltirin ve tek bir güç ortamı hazırlanın. Şimdi cinsel olarak olgun erkek ve dişi yetişkin zebra balığını seçin. Çıkarılabilir bölücülü üreme tankları kullanarak kontrollü yetiştirme gerçekleştirin.

Saat 20:00'te, erkek ve dişi zebrabalıkları, iki erkek üç dişi oranında üreme tanklarının ayrı bölümlerine yerleştirin; ayırıcı kullanılarak ayrı tutulmaları sağlanır. Ertesi sabah saat 8:00'de, çiftleşme için bölücüleri çıkarın. Embriyoları bir saat sonra topla ve temiz sistem suyla üç kez yıkay.

Embriyoları, 20 mililitre taze E3 ortamı içeren 100 milimetrelik Petri kaplarında barındırın. Sonra embriyoları 28 derece Celsius sıcaklığında, 14 saatlik ışık ve 10 saatlik karanlık döngü altında kuluçkaya geçirin. Döllenmeden bir gün sonra, döllenmemiş, şekilsiz ve anormal embriyoları dikkatlice bir mera pipeti ile çıkarın.

Petri kabının kenarından ortamı yavaşça aspire edin ve Petri kabının duvarına taze E3 embriyo ortamı ekleyin; böylece yabani tip embriyoların rahatsızlığı minimuma endirilecektir. MPTP ile tedavi edilen grup için 50 mikromolar MPTP çözeltisi kullanın. Döllenmeden dört gün sonra, üç mililitrelik bir otlak pipetini ucundan 10 milimetre keserek geniş bir delik oluşturarak değiştirin.

Saat 18:00'de, modifiye pipetle her gruptan zebrafish larvalarını seçin ve her kuyu için bir larvanı 96 kuyruklu bir plakaya aktarın. Her bir zebrafish larvasının sağlıklı göründüğünü doğrulamak için her kuyuyu stereo mikroskop altında inceleyin. Yüzgeçlerin açık ve düzenli sallandığını, vücudun dik olduğunu ve yüzme merdiveninin şişirildiğini kontrol edin.

Sonrasında, plağın altını dikkatlice temizleyin, böylece kir video takip sonuçlarını etkilemesini önleyin. Sonra 96 kuyruklu plakayı merkezi olarak zebra kutusu odasının dibine aktarın. Video takip yazılımında kuantizasyon modunu seçin.

Uyku uyanıklığı düzenlemesi için ışık ayarını saat 22:00'de kapatıp 8:00'de açacak şekilde ayarlayın. Yazılım parametrelerini tespit eşiği 40, patlama 25, dondurma 4, toplam izleme süresi 52 saat ve ardından 60 saniye olarak ayarlanacak şekilde yapılandırın. Uyku uyanışma işlemini saat 8:00'de başlatın PM.To fotomotor tepkileri izleyin, döllenme sonrası beş gün sonra larvaları 96 kuyu içinde bir larva içeren bir plakaya yerleştirin. Sonra ışık geçiş programını sıfırdan 60 saniyeye kadar karanlık, ardından 60 ila 120 saniye arasında sürekli ışık ayarlayın.

Protokolü başlatın ve 120 saniyelik test boyunca her altı saniyede bir hareket parametreleri toplayın. Protokolü 120 saniyede durdurun ve veri dosyasını dışa aktarın. Sonra larvaları tam karanlığa beş dakika boyunca bırakarak ardından koyu strob ışığı testi için alıştırın.

Işık geçiş programını 60 saniye boyunca 10 hertz'de strob ışığı verecek şekilde ayarlayın. Thigmotaksisi değerlendirmek için iki altı kuyu plakası seçin. Her kuyuyu dört mililitre E3 ortamla doldurun.

Döllenmeden beş gün sonra, yabani tip grubundan ve MPTP tedavi edilen gruptan zebrafish larvalarını toplayın ve ayrı altı kuyu plakasına yerleştirin. Tigmotaksis değerlendirmesinden önce, uyum sağlamak için kuyu plakalarını zebra kutusuna 15 dakika koyun. Sonra çekme alanı fonksiyonunu kullanarak her kuyuda iç daire yarıçapı kuyunun yarıyarıçapına eşit iki konsantrik daire çizer ve değerlendirmeye başlar.

Lokomotor değerlendirme için, yabani tip grubundan ve MPTP tarafından tedavi edilen gruptan beş günlük zebrafish larvalarını iki ayrı 12 kuyu plakasına aktarın. 15 dakikalık bir alışmanın ardından, izleme çevrimiçi analiz modunu seçin ve otomatik video takip sistemi kullanarak beş dakika boyunca lokomotor aktiviteyi kaydedin. Şaşırtma tepki testi için, beş günlük larvaları ayrı ayrı iki 12 kuyu tabakasına aktarın; her kuyuda bir larva ve iki mililitre E3 ortamı var.

Plakaları zebra kutusuna koyarak beş dakikalık hafif alışma süresi için. ZebraLab yazılımını başlatın ve takip online analiz modunu etkinleştirin. Işık tetikleme arayüzünü açın, sonra aşağıdaki üç tetikleme yönteminden birini seçin ve geliştirilmiş uyarıcıları etkinleştirin.

Sonra, başlangıç yöntemini oturumun başladığı zamana ayarlayın. Geçiş programında, karanlık flaş ritmini tanımlayın. Programı 21 saniye sonra tetiklenecek şekilde ayarlayın, ardından geçişi %100 ışık yoğunluğuyla bir milisaniyeye ayarlayın.

İki saniyeden 2,890 milisaniyeye geçiş yapın ve %100 ışık yoğunluğu. Üç ila beş milisaniye geçişi %0 ışık yoğunluğu ile ve dört ila 100 milisaniye arasında %0 ışık yoğunluğu ile geçiş yapın. Periyodik yanıb-sönme için tekrar listesi kutusunu işaretleyin ve ardından protokolü başlatın.

Açık koyu meydan okuma testi için, zebrafish larvalarını her kuyuda bir larva ve bir mililitre E3 ortamı olan iki 24 delikli plakaya aktarın. Zebra kutusunda beş dakikalık bir alışma yaptıktan sonra, takip analizi çevrimiçi modunu açın. Sonra ışık programını altı dakika sabit ışık ve ardından dört dakika tam karanlık olarak ayarlayın.

10. dakikada, davranışsal kaydı durdurun ve verileri kaydedin. Tabağı zebra kutusundan dikkatlice çıkarın. Her davranışsal deneyden sonra, MPTP temas edilen tüm yüzeyleri taze hazırlanmış sodyum hipoklorit çözeltisiyle sprey ve silin.

MPTP içeren sıvı ve katı atıkları toplayın ve bunları tehlikeli nörotoksik atık olarak açıkça etiketleyin. Tüm kirlenmiş malzemeleri taze hazırlanmış sodyum hipoklorit çözeltisiyle tedavi edin. Tedavi edilen zebrafish larvalarında, yabani tip grubuna kıyasla uyku ve uyanıklık aktivitesi izlerinin bozulduğunu gösterdi.

Tedavi edilen grupta toplam uyku süresi de önemli ölçüde arttı. Tedavi edilen grupta uyku çıkış sayısı önemli ölçüde azalmış, ortalama uyku süresi ise artmıştır. Uyanık aktivite ve ortalama aktivite tedavi edilen grupta anlamlı şekilde düştü.

Sürekli ışık altında, işlenmiş grubun donma indeksi önemli ölçüde artmıştır. Ayrıca 10 hertz'te strob ışığı uyarısı altında da önemli ölçüde arttı. Fotomotor yanıt eğrileri, tedavi edilen grupta reaktivitenin azaldığını gösterdi.

İzleme sonuçları, tedavi edilen grupta hareket ve keşif davranışlarının azaldığını gösterdi. Tedavi edilen grupta toplam yüzme ve ortalama yüzme hızı da önemli ölçüde azaldı. Donma hareket süresi oranı tedavi edilen grupta belirgin şekilde daha yüksekti, ancak hızlı hareket süresi oranı önemli ölçüde daha düşüktü.

Dönüşümlü ışık ve karanlık geçişler, yabani tip larvalarda belirgin hız zirveleri oluşturdu. Tedavi edilen grupta uyarı sonrası mesafe yüzme ve uyarı sonrası zirve hız anlamlı şekilde azaldı. Tedavi edilen grupta gecikmeden tepe hıza kadar hareket başlangıcı, önemli ölçüde gecikti.

Temel zorluk, bireysel değişkenliği hesaba katarak zebrafish seviyesinde doğru ve tekrarlanabilir davranış analizini sağlamak için iç belirleyicileri en aza indirmektir. Davranışsal kümeleme ve fenomen profilleme, ince nörotoksik etkileri ortaya çıkarmak ve daha derin manyetik içgörüler elde etmek için uygulanabilir. Gelecekteki çalışmalar, bu platformu zebrafish Parkinson Hastalığı modellerinde risk onaylı ilaç taraması ve farmakolojik değerlendirmeye uygulayabilir.