Merkezi Sinir Sistemi Patogenlerinin Tespiti İçin Beyin Omurilik Sıvısının Metagenomik Yeni Nesil Dizilemesi

Bu, potansiyel patojenlerin tespit edilmesini sağlamak için beyin omurilik sıvısı örneklerinin Metagenomik Yeni nesil dizilenmesi için araştırma temelli bir protokoldür. Mevcut MNGS protokolleri, CSF içindeki düşük RNA verimini hesaba katmaz. Bu protokol, bu örneklerdeki düşük biyokütleyi hesaba katmak için birkaç adımı optimize eder.

BOKS örneklerini buz üzerinde eritmeye başlamak için, her numuneden 100 mikrolitre 100 mikrolitre bir mililitre aktarın ve 16.000 G'de dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Sonra süpernatantı dikkatlice pipetleyin, ardından pellet ve 100 mikrolitre süpernatant bırakılsın. Kalan 100 mikrolitre süpernatant ve pellete 100 mikrolitre DNA RNA kalkanı ekleyin ve iyice karıştırın.

Sonra 600 mikrolitre DNA RNA lizin tamponu ekleyin ve çözelti homojen olana kadar pipetle karıştırın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak DNA ve RNA çıkarma protokolünü aşağıdaki önemli değişikliklerle gerçekleştirin. Tüm santrifüj adımlarını maksimum hızda bir dakika boyunca gerçekleştirin, son DNA RNA yıkaması hariç, ki bu üç dakika boyunca santrifüjlenmelidir.

Örneği elyasyon etmek için, sütun matrisine doğrudan 22 mikrolitre nukleaz içermeyen su ekleyin. Sonra oda sıcaklığında üç dakika kuluçka yapın. Ellecian pipetinden sonra akış tekrar sütun matrisine doğru ilerliyor, maksimum hızda bir dakika boyunca tekrar santrifüj yapıldıktan sonra örneği yeni bir 1,5 mililitrelik depolama tüpüne aktarıyor.

RNA parçalanması ve priming için gereken bileşenleri bir PCR tüpünde pipetleyin. Tüpü bir termosiklere içinde, kapağı ısıtılmış 105 derece Celsius olarak ayarlayın. Pipet, parçalanmış ve astarlanmış RNA'yı sekiz mikrolitre nukleaz serbest su ve iki mikrolitre birinci iplik sentez enzim karışımıyla karıştırın.

Tüpü bir termosiklere içinde, kapağı ısıtılmış 105 derece Celsius olarak ayarlayın. Sonra ilk iplikteki sentezlenen DNA'yı 48 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile karıştırın. Sekiz mikrolitre ikinci iplik sentez reaksiyon tamponu ve dört mikrolitre ikinci iplik sentez enzim karışımı.

Tüpü bir termosiklere yerleştirin ve ısıtılmış kapağı kapalı olarak 16 derece sıcaklıkta bir saat kuluçka yapın. Sonra, 1,8 katı fazlı tersiner immobilizasyon manyetik boncukları oranıyla manyetik boncuk arıtması gerçekleştirilir. Örneği 53 mikrolitre nukleazsız suya elütasyon yapın.

Saflaştırılmış çift zincirli CDNA içeren son süpernattan 50 mikrolitresini temiz bir nükleaz içermeyen PCR tüpüne aktarın. Bu noktada, örnekler gece boyunca eksi 20 derece Celsius sıcaklıkta dondurulabilir. Numune gece boyunca eksi 20 derece Celsius sıcaklıkta saklandıysa, buzda eriyip tekrar başlatın.

Pipet, 50 mikrolitre saflaştırılmış çift zincirli CDNA, yedi mikrolitre son hazırlık reaksiyon tamponu ve üç mikrolitre son hazırlık enzim karışımı ile karıştırın. Örnekleri termosiklere yerleştirin ve ısıtılmış kapağı kapalı olarak 20 derece Celsius'ta 30 dakika ve 65 derece Celsius'ta 30 dakika kuluçka yapın. Sonra, adaptör ligasyon adımını buz üzerinde uygulamak, önce nukleazsız suda birden 100'e kadar bir sulandırılmış adaptör oluşturmaktır.

Son hazırlık reaksiyon karışımını 30 mikrolitre ligasyon master karışımı, bir mikrolitre ligasyon güçlendirici ve 2,5 mikrolitre seyreltilmiş adaptör içeren bir tüpe içine pipetleyin. Örnekleri bir termosiklere yerleştirin ve ısıtılmış kapağı kapalı olarak 15 dakika boyunca 20 derece Celsius sıcaklığında kuluçka yapın. Bundan sonra, katı faz tersiner immobilizasyon manyetik boncuklarının 0,9 katı oranı kullanılarak hemen manyetik boncuk saflatmasına geçilir.

Sonra 17 mikrolitre nükleaz içermeyen suya elüasyon yapın. Son süpernatanttan 15 mikrolitre temiz nükleaz içermeyen PCR tüpüne aktarın. Şimdi pipet arıtılmış adaptörüyle CDNA'yı üç mikrolitre kullanıcı enzimi, 25 mikrolitre Q beş master karışımı ve 10 mikrolitre benzersiz barkodlu primer içeren bir tüp haline getirdi.

Tüpü ısıtılmış kapağı 105 derece Celsius'a ayarlayarak bir termosiklere yerleştirin ve mevcut koşullarda kuluçka yapın. 0,8 katı manyetik boncuk oranı kullanılarak son manyetik boncuk arıtması gerçekleştirin. Sonra örneği 23 mikrolitre nukleaz içermeyen suya elüasyon yapın.

Son süpernatanttan 20 mikrolitreyi temiz bir nükleaz içermeyen PCR tüpüne aktarın. Örnek kütüphanelerinin konsantrasyonunu DNA nicelendirme kiti ve ilgili florimetre kullanarak nicelikle ölçün. Su kontrollerinin diğer örneklere kıyasla önemli ölçüde daha düşük veya ölçülemez konsantrasyonlara sahip olduğunu doğrulayın.

Örnek kütüphanesi boyutlarını otomatik bir kapiller elektroforez makinesinde çalıştırarak değerlendirin. Patojen tespiti için metagenomik analiz yapmak amacıyla açık kaynaklı web tabanlı platform Chan Zuckerberg ID'yi kullanın. Chan Zuckerberg ID'ye giriş yapın ve yükle tuşuna tıklayın.

Analiz türü olarak metagenomikleri seçin ve dizileme çalışmasından giriş FASTQ dosyalarını seçin. Örnek adı, örnek tipi BOKS ve nükleotit tipi RNA veya DNA dahil olmak üzere gerekli örnek bilgilerini girin. İşlem tamamlandıktan sonra, örneklerin bulunduğu proje klasörüne tıklayın ve özet paneline gidin.

Örnek başına okunma sayısını incelemek için aşağıya kaydırın. Kalite kontrol filtresinden geçen okuma yüzdesini ve çift sıkıştırma oranını inceleyerek önyargılı PCR ile güçlendirmeyi değerlendirin. Proje klasöründeki yabancı DNA kontaminasyonunu belirlemek için, her su kontrol örneğini seçin ve modeli oluşturmak için arka plan modeline tıklayın.

Analiz sırasında, modeli uygulayın ve olası kirleticileri çıkarmak için NTZ puanını birden büyük ayarlamak için eşik filtreleri kullanın. Sonra verileri uygun istatistiksel yazılımla analiz edin. Kapiler elektroforez ve elektroferogram verileri, CDNA örnek kütüphanesinin aşırı parçalanmış ve dizileme için kullanılmayan adaptör dimerler içerdiğini gösterdi.

CDNA kütüphanesi, önemli adaptör dimer kirlemesi olmadan havuzlama ve dizileme için hazırdı. BOĞS metagenomik Yeni nesil dizilemesi, A ve B kohortlarında en az bir patojenle birlikte çeşitli patojenler tespit etti; kohort A örneklerinin %73,5'inde ve B kohort örneklerinin %51,2'sinde en az bir patojen. Önemli bir zorluk, düşük hacimler ve az veya fazla kurutmanın sonuçları bozabileceği zamana duyarlı B kurutma nedeniyle hassas pipetlemedir.

Bu özel protokol patojen tespiti tarafına odaklansa da, bu protokol tarafından üretilen konak RNA transkriptleri ek sonraki analizler için kullanılabilir. Bu nedenle, gelecekteki çalışmalar için bu özel kütüphane hazırlama ve dizileme protokolünün performansını, seyrek örnekler için tasarlanmış yeni yöntemlerle karşılaştırmak ve sadece patojen tespiti açısından değil, aynı zamanda transkriptomik analizler açısından da nasıl eşleştiğini görmek önemlidir.