Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Araştırmamız, geleneksel mikroskopinin kırınım sınırını aşarak dinamik subhücre yapılarını görselleştirmek için erişilebilir süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri geliştirmeye odaklanmaktadır. Süper çözünürlüklü yöntem fototoksisite, karmaşık işlem ve özel hazırlıkla karşı karşıyadır. Bu protokol, konfokal tabanlı çoklu algılama yoluyla bu engelleri azaltır.

Başlamak için mikroskop ana ünitesini, lazer fırlatma modülünü, LED ışık kaynağını ve kontrol bilgisayarını açın. Mikroskop işletim yazılımını başlatın. Ana arayüzden GFP seçin, ardından yansıyan ışığı kapatın.

Satın alma paneline gidin. Objektif lens açılır menüsünden uygun objektif lensi seçin. Canlı hücre görüntüleme için, görüntülemeden 45 ila 60 dakika önce, çevresel odayı ve aktif odak stabilizasyon sistemini aktive eder.

Sistem stabilize edildikten sonra, oda sensörleriyle stabiliteyi doğrulayın. ObjektİFin ön lensine baloncuk oluşturmadan daldırma yağı uygulayın. Hazırlanan örneği mikroskop aşamasına yerleştirin.

Örtü damlatma yağına temas edene kadar dikkatlice kaldırın. Sonra, satın alma yazılımını açın. Edinim sekmesine gidin ve yeni bir deney oluştur seçeneğini seçin.

Şimdi, kullanılan floroforlar için görüntüleme izleri ekleyin. Her ray için konfokal iğne deliği çapını bir hava ünitesine ayarlayın. Lazer gücünü optimize etmek için ilk kanalı seçin ve canlı tarama moduna geçin.

Başlangıç lazer gücünü düşük bir değere ayarlayın, ardından dedektör kazancını doğrusal aralığında orta seviyeye ayarlayın. Bundan sonra, hedef yapılar canlı görüntüde arka planın üzerinde net görünür hale gelene kadar lazer gücünü kademeli olarak artırın. Piksel boyutunu yazılımın Nyquist örnekleme düğmesini kullanarak otomatik olarak hesaplayın.

Sonra, piksel süresini ayarlayın. Şimdi, çapraz konuşmayı en aza indirmek için pistler arasında ardışık tarama modunu seçin. Tek bir görüntü almak için Snap'e tıklayın.

Fotoğrafı ilgili meta verilerle birlikte kaydedin. Optik bölümler arasında tutarlı ayarlar için, tüm görüntüleme parametrelerinin tek bir optimal odak düzleminde yapılandırıldığını doğrulayın, ardından Z-yığını tanımlanır. Acquisition sekmesini açın ve Z-stack modunu seçin.

İlgi hacmini hızlı hızlı canlı tarama kullanarak önce en alttaki ilgi yapısına odaklanın, ardından Son Set veya Bottom'a tıklayın. İlgi alanının en üst yapısına dikkatlice odaklanın ve Set First veya Top tuşuna tıklayın. Yazılım daha sonra toplam derinliği gösterir.

Z-yığını boyutu, Nyquist örnekleme kriterini karşılayacak şekilde ayarlanmıştır. Optimal butonunu kullanarak otomatik olarak hesaplayın. Her kanal için görüntüleme parametreleri yapılandırıldıktan sonra, tek bir iki boyutlu görüntüye kıyasla zayıf sinyaller için lazer gücünü veya kazancı biraz artırın.

Tüm görsel yığını toplamak için satın alma işlemini başlatın. Görselleştirme için mikroskobun doğal işleme modülünü kullanın. Tüm odak sinyallerini tek bir iki boyutlu görüntüde görüntülemek için maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun.

Sonra, yazılımın yerleşik algoritmalarını kullanarak hacim renderı yaparak üç boyutlu bir temsil oluşturulur. Parlaklığı, opaklığı ve aydınlatmayı gerektiğinde ayarlayın. Daha sonra, eksenel kapsam ve kayıt denetlemek için ortogonal XZ ve YZ kesitleri oluşturulur.

Sabit COS-7 hücrelerinin çok renkli floresan görüntülemesi, çekirdeklerin, mitokondrilerin ve mikrotübüllerin minimal örtüşmeyle net şekilde işaretlendiğini göstererek etkili ardışık tarama ve optimize edilmiş tespiti doğruladı. Maksimum yoğunluk projeksiyonu, tüm optik bölümlerde sinyalleri entegre eder ve floresan etiketli yapıların mekansal dağılımını vurgular. Üç boyutlu bir yeniden yapılandırma, örnek mimarinin derinlik farkındalığını sağlayan bir görünüm sunar.

Canlı Hep 3B hücrelerinin EFP etiketli mitokondrilere sahip zaman geçişli görüntülemesi modlar arasında karşılaştırılır. Zaman noktaları arasındaki konfokal çerçeveler net yapılar gösterir, ancak sinyal kaybı kademeli olur. Standart süper çözünürlüklü veya SR kareler daha yüksek çözünürlük gösterir, ancak zamanla daha fazla fotoğraf ağartma gösterir.

Hızlı süper çözünürlüklü veya SR-4Y görüntüleri, sonraki zaman noktalarında bile stabil floresansı korur. 100 zaman noktasındaki ortalama EGFP floresans yoğunluğunun grafiği, SR-4Y modunun en kararlı sinyali koruduğunu göstermektedir. Sabit COS-7 hücrelerindeki görüntüleme performansı modlar arasında karşılaştırıldı ve süper çözünürlüklü modlar konfokalden daha net yapısal detaylar sağladı.

100 nanometrelik floresan boncuklarla nokta yayılım fonksiyonunun ölçülmesi, Airyscan SR'nin ardından eklem dekonvolüsyonuyla birlikte hem yanal hem de eksenel çözünürlüğün yalnızca Airyscan SR'ye kıyasla daha iyi olduğunu gösterdi. Bu protokol, araştırmacıların hem sabit hem de canlı hücrelerde organel morfolojisi, sitoskelet dinamikleri ve molekül kololokalizasyonunu yaklaşık 120 nanometre çözünürlükte incelemelerine olanak tanır. Bu protokolün en kritik noktası, yüksek kaliteli kaplama camı ve optimize edilmiş boyama kullanılarak titiz örnek hazırlamaktır; bu da süper çözünürlüklü işlem için sinyal bütünlüğünü sağlar.

Bu prosedürü takip ettiğinizde, araştırmacılar ImageJ gibi özel yazılımları kullanarak sinyal-gürültü oranı veya kololokalizasyon gibi nicel görüntü analizi yapabilirler.