Name: Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin, süper çözünürlüklü hücre görüntüleme için konfokal mikroskopi ve çoklu algılama kullanarak yaklaşık 120 nm çözünürlükte organel morfolojisini incelemeyi. Bu yöntem hem sabit hem de canlı hücrelerde alt hücresel yapıları görselleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Prakash, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+in+super-resolution+microscopy+-+definition%2C+trade-offs+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution in super-resolution microscopy - definition, trade-offs and perspectives.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 677-682 (2024).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nat Cell Biol. 21, 72-84 (2019).</li>
<li>Bond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+advances+in+super-resolution+microscopy+to+study+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes.</a> Mol Cell. 82, 315-332 (2022).</li>
<li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+2D+super-resolution+mode+for+ZEISS+Airyscan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The new 2D super-resolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nat Methods. 14, 1223(2017).</li>
<li>Wu, X., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEISS+Airyscan%3A+Optimizing+Usage+for+Fast+Gentle%2C+Super-Resolution+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ZEISS Airyscan: Optimizing Usage for Fast Gentle, Super-Resolution Imaging.</a> Methods Mol Biol. 2304, 111-130 (2021).</li>
<li>Yin, W., Liu, S. S., Zhao, Q. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+strategy+for+fast+super-resolution+imaging+parameters+based+on+LSM+900%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization strategy for fast super-resolution imaging parameters based on LSM 900.</a> Chin J Cell Biol. 47, 1644-1655 (2025).</li>
<li>Moore, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cables+and+comet+tails+organize+mitochondrial+networks+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis.</a> Nature. 591, 659-664 (2021).</li>
<li>Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+live+cell+imaging+of+subcellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution live cell imaging of subcellular structures.</a> J Vis Exp. (167), e61563(2021).</li>
<li>Harmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airyscan+super+resolution+microscopy+to+study+trypanosomatid+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Airyscan super resolution microscopy to study trypanosomatid cell biology.</a> Methods Mol Biol. 2116, 449-461 (2020).</li>
<li>Lin, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+functions+and+management+of+laser+scanning+confocal+microscopy+LSM880+with+Airyscan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chin+Electron+Microsc+Soc%22%5BJournal%5D)">Advanced functions and management of laser scanning confocal microscopy LSM880 with Airyscan.</a> J Chin Electron Microsc Soc. 38, 271-275 (2019).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+imaging+characteristics+and+applications+of+LSCM880+with+Airyscan+and+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Innov+Appl%22%5BJournal%5D)">Comparative study on imaging characteristics and applications of LSCM880 with Airyscan and spinning disk confocal microscopy.</a> Technol Innov Appl. 32, 4-8 (2020).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. 16, 1159-1163 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+Vasohibin+1+speeds+contraction+and+relaxation+in+failing+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of Vasohibin 1 speeds contraction and relaxation in failing human cardiomyocytes.</a> Circ Res. 127, 14-27 (2020).</li>
<li>Sandin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+simultaneous+laser+scanning+confocal+and+atomic+force+microscopy+%28conpokal%29+on+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Near simultaneous laser scanning confocal and atomic force microscopy (conpokal) on live cells.</a> J Vis Exp. (162), e61433(2020).</li>
<li>Castagnini, D., Palma, K., Jara Wilde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Imaging+of+Proteus+mirabilis+biofilm+by+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Imaging of Proteus mirabilis biofilm by expansion microscopy.</a> J Vis Exp. (221), e67932(2025).</li>
<li>Wolf, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+live-cell+super-resolution+imaging+of+mitochondrial+cristae+and+quantification+of+submitochondrial+membrane+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Method for live-cell super-resolution imaging of mitochondrial cristae and quantification of submitochondrial membrane potentials.</a> Methods Cell Biol. 155, 545-555 (2020).</li>
<li>Wu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+perylene+carboximide+fluorophores+for+live-cell+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Near-infrared perylene carboximide fluorophores for live-cell super-resolution imaging.</a> J Am Chem Soc. 146, 7135-7139 (2024).</li>
<li>Pfanzelter, J., Mostowy, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+suppress+the+release+of+vaccinia+virus+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins suppress the release of vaccinia virus from infected cells.</a> J Cell Biol. 217, 2911-2929 (2018).</li>
<li>Kolossov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airyscan+super-resolution+microscopy+of+mitochondrial+morphology+and+dynamics+in+living+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Airyscan super-resolution microscopy of mitochondrial morphology and dynamics in living tumor cells.</a> Microsc Res Tech. 81, 115-128 (2018).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+macrophages+monitor+and+remove+particles+from+urine+to+prevent+tubule+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Renal macrophages monitor and remove particles from urine to prevent tubule obstruction.</a> Immunity. 57, 106-123 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&nbsp; COS7 hücreleri</td><td>ATCC (veya benzeri)</td><td>CRL-1651</td><td>Afrika yeşil maymun böbreği fibroblast hücre hattı. Çok renkli süper çözünürlüklü görüntüleme için sabit hücre örneklerinin hazırlanmasında kullanılır;</td></tr><tr><td>&nbsp; Eşek anti-fare IgG, Alexa Fluor 568 konjugatı</td><td>Invitrogen (veya benzeri)</td><td>A10037</td><td>Mikrotübul boyama için ikincil antikor. 1:500 seyreltme ile kullanılır</td></tr><tr><td>&nbsp; Dulbecco' s modifiye kartal ortamı (DMEM), yüksek glikoz</td><td>Gibco (veya benzeri)</td><td>11965092</td><td>COS7 hücreleri için standart kültür ortamı, %10 FBS takviyesi.</td></tr><tr><td>&nbsp; Fetal Sığır Serumu (FBS), ısıyla inaktive edilmiş</td><td>Gibco (veya benzeri)</td><td>10082147</td><td>Serum takviyesi tüm hücre kültür ortamlarında %10 (v/v) oranında kullanılmıştır.</td></tr><tr><td>&nbsp; Cam tabanlı Görüntüleme Çanakı (35 mm, &micro;-Çanak, #1.5 polimer kapak kayağı, 0.17 mm kalınlık)</td><td>ibidi (veya benzeri)</td><td>81156</td><td>Hücre kaplaması ve görüntüleme için substrat. Yüksek NA yağ batırılma hedefleriyle uyumluluk açısından kritik.</td></tr><tr><td>&nbsp; Görüntü İşleme & analiz yazılımı (ZEN modülleri)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>ZEN 3.5 (mavi)</td><td>3D yeniden yapılandırma, süper çözünürlüklü işleme (örneğin, Airyscan İşleme), PSF ölçümü ve SNR analizi için kullanılır.</td></tr><tr><td>&nbsp; ImageJ / Fiji</td><td>Açık Kaynak</td><td>Yok</td><td>Ek 3D yeniden yapılandırma, ortogonal görünümler oluşturmak ve genel görüntü analizi için kullanılır.</td></tr><tr><td>&nbsp; Daldırma yağı (Kırılma İndeksi = 1.518)</td><td>Carl Zeiss (veya benzeri)</td><td>444960-0000-000</td><td>Yağ batdırma objektifleri için (örneğin, 63x/1.4 NA).</td></tr><tr><td>&nbsp; Çoklu dizi dedektörü ile lazer taramalı konfokal mikroskop sistemi (örneğin, Airyscan 2 ile ZEISS LSM 900)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 900 (Airyscan 2)</td><td>Protokolde tanımlanan tüm konfokal ve süper çözünürlüklü modlar için kullanılan birincil görüntüleme platformu.</td></tr><tr><td>&nbsp; Earle ile Minimum Temel Orta (MEM) s Tuzları</td><td>Gibco (veya benzeri)</td><td>11095080</td><td>Hep3B hücreleri için standart kültür ortamı, %10 FBS takviyesi.</td></tr><tr><td>&nbsp; Fare anti-&alfa;-tubulin monoklonal antikor (Klon DM1A)</td><td>Sigma-Aldrich (veya benzeri)</td><td>T6199</td><td>Mikrotubulların etiketlenmesi için birincil antikor. 1:500 seyreltme ile kullanılır</td></tr><tr><td>&nbsp; Paraformaldehit (PFA), PBS'de %4</td><td>&nbsp; Jinpan&nbsp; (veya benzeri)</td><td>TBS5083</td><td>Hücreler için sabitleyici. Oda sıcaklığında 15 dakika kullanın. Uygun önlemlerle müdahale edin.</td></tr><tr><td>&nbsp; Fenol-kırmızısı olmayan görüntüleme ortamı</td><td>Gibco (veya benzeri)</td><td>21063029</td><td>Canlı hücre görüntüleme için kullanılan düşük otofloresans ortamı. %5 CO2 ile 37°°° derecede önceden dengelenmiştir; Kullanmadan önce C.</td></tr><tr><td>&nbsp; Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS), 1X, pH 7.4</td><td>CellWorld (veya benzeri)</td><td>C0162-311</td><td>Protokol boyunca yıkama ve seyreltme tamponu olarak kullanıldı.</td></tr><tr><td>&nbsp; ProLong altın antiifade montaj cihazı</td><td>Invitrogen (veya benzeri)</td><td>P36930</td><td>Sabit örneklerde floresansı korumak için sertleştirilmiş montaj ortamı.</td></tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (veya benzeri)</td><td>T8787</td><td>Hücre geçirgenliği için %0,1 (v/v) oranında kullanılmıştır</td></tr><tr><td>&nbsp; Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich (veya benzeri)</td><td>P9416</td><td>Antikor kuluçkasından sonra yıkama adımlarında PBS (PBST) içinde %0,05 (v/v) oranında kullanılır.</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA), Fraction V</td><td>Sigma-Aldrich (veya benzeri)</td><td>A7906</td><td>PBS'de bloklama ve antikor seyreltme tamponunun bir bileşeni olarak %1 (w/v) olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Sigma-Aldrich (veya benzeri)</td><td>D9542</td><td>Nükleer karşı leke. Son konsantrasyon 1 & mikro; g/mL.</td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 488 eşlenimi</td><td>Invitrogen (veya benzeri)</td><td>A21206</td><td>Mitokondriyal boyama için ikincil antikor. 1:500 seyreltme ile kullanılır</td></tr><tr><td>Floresan mikroküreler (boncuklar), çapı 100 nm</td><td>Invitrogen (örneğin, TetraSpeck&trade;) veya benzeri</td><td>T7279</td><td>Sistemin ampirik ölçümü için kullanılır' s nokta yayılım fonksiyonu (PSF) ve çözünürlük.</td></tr><tr><td>EGFP-mitokondrileri stabil şekilde ifade eden Hep3B hücreleri</td><td>IMMOCELL</td><td>IM-H367</td><td>Mitokondriyal matrikse hedeflenen EGFP'yi istikrarlı şekilde ifade etmek üzere insan hepatom hücre hattı tasarlandı. Canlı hücre zaman geçişli görüntüleme için kullanılır.</td></tr><tr><td>HEPES tampon çözeltisi, 1 M</td><td>Gibco (veya benzeri)</td><td>15630080</td><td>CO2 kuluçka makinesi dışında canlı görüntüleme sırasında pH stabilizasyonu için görüntüleme ortamında son konsantrasyon olarak 25 mM konsantrasyonda kullanılır.</td></tr><tr><td>Yüksek hassasiyetli kaplama camı (#1.5, 0.17 mm kalınlığı)</td><td>Marienfeld (veya benzeri)</td><td>107052</td><td>Sabit örnekleri monte etmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Mikroskop işletim yazılımı (örneğin, ZEN mavi baskısı)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>ZEN 3.5 (mavi)</td><td>Sistem kontrolü, görüntü edinimi ve temel işleme için kullanılır.</td></tr><tr><td>Objektif lens: Plan-apokromat 63x/1.40 NA Oil DIC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>421462-9900-000</td><td>Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılan birincil hedef.</td></tr><tr><td>Tavşan anti-TOMM20 poliklonal antikor</td><td>Abcam (veya benzeri)</td><td>AB186735</td><td>Mitokondri etiketlemesi için birincil antikor. 1:1000 seyreltme ve nbsp ile kullanılır;</td></tr></tbody></table>

süper Çözünürlüklü görüntüleme ve paylaşılan yönetim: multiplex algılama ile konfokal mikroskopi İçin bir protokol

Super-Resolution Imaging and Shared Management: A Protocol for Confocal Microscopy with Multiplex Detection

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Super-resolution microscopy (SRM) overcomes the diffraction limit of conventional light microscopy, enabling nanoscale visualization of subcellular ...

super-resolution-imaging-shared-management-protocol-for-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Neisseria meningitidis (Nm), gram negatif bir insana özgü solunum patojen, insan α-aktinin bağlayabilirsiniz . Burada insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) içine bakteriyel girmesinden sonra intraselüler α-aktinin bakterinin colocalisation görselleştirilmesi için bir protokol mevcut.

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis</emKonfokal Görüntüleme α-aktinin> ve İnsan

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Floro etiketli antikorların ardışık bağlanması ve elüsyonunu kullanarak heterojen nano yapılardaki çoklu molekülleri tek molekül doğruluğu ile görüntüleme yöntemi gösteriyoruz.

Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Bu yazıda, ara yüz morfolojisini görselleştirirken ara yüz gerilimi ve yüzey dilatasyonel reolojisinin eşzamanlı ölçümlerini yapmak için bir mikrotensiyometre/konfokal mikroskobun tasarımı ve çalışması anlatılmaktadır. Bu, teknoloji ve fizyolojide önemli olan arayüzlerin yapı-özellik ilişkilerinin gerçek zamanlı olarak inşasını sağlar.

Dinamik Arayüzlerin Konfokal Mikroskopi Görselleştirmesi için Mikrotensiyometre

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Spektral Yinelemeli Ağartma Çoklamayı Genişletir (IBEX), spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için heparin blokajı ekleyerek ve otofloresansı bastırmak için hesaplamalı karıştırma ile spektral algılamadan yararlanarak temel IBEX tekniğini temel alır. Bu yaklaşım, arka plan kaynaklarını azaltırken görüntü elde etmeyi hızlandırır ve sağlam, çok yönlü, yüksek parametreli uzamsal proteomik analizlere olanak tanır.

Spesifik Olmayan Doku Floresansını En Aza İndirmek için Spektral Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Pleks Görüntüleme

Bu protokol, optik foton yeniden atamalı olan dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak derin, tam hücre tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) uygulanma prosedürünü özetler; böylece özel optik veya karmaşık aydınlatmaya ihtiyaç olmadan DNA-PAINT görüntüleme mümkün olur.

Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme

Öğrenin, süper çözünürlüklü hücre görüntüleme için konfokal mikroskopi ve çoklu algılama kullanarak yaklaşık 120 nm çözünürlükte organel morfolojisini incelemeyi. Bu yöntem hem sabit hem de canlı hücrelerde alt hücresel yapıları görselleştirir.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Daha fazla video keşfet