Name: Birincil insan T hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici transfeksiyonu için kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri üretmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin, birincil insan T hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici mRNA elektroporasyonu ile kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri üretme yöntemini. Bu protokol hızlı CAR yapısı taraması ve fonksiyonel analiz için esnek bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T+cell+receptor-induced+proximal+signaling+and+downstream+functions+in+immortalized+and+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells.</a> PLoS One. 4 (5), e5430(2009).</li>
<li>Smeets, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+profiling+of+T+lymphocyte+signal+transduction+pathways%3B+Th1+and+Th2+genomic+fingerprints+are+defined+by+TCR+and+CD28-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling.</a> BMC Immunol. 13 (12), (2012).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T-cell+lines+exhibit+marked+genomic+instability+affecting+karyotype%2C+mutational+profile%2C+gene+expression%2C+immunophenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function.</a> Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).</li>
<li>Dobersberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineering+strategy+to+target+activated+EGFR+with+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells.</a> Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).</li>
<li>Van Bruggen, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+cells+impair+mitochondrial+fitness+in+CD8%2B+T+cells+and+impede+CAR+T-cell+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy.</a> Blood. 134 (1), 44-58 (2019).</li>
<li>Hoffmann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+expansion+potential+of+naive+chimeric+antigen+receptor+T+cells+from+healthy+donors+and+untreated+chronic+lymphocytic+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients.</a> Front Immunol. 8 (1956), (2017).</li>
<li>Zhang, D. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR-T+cell+functionality+in+a+patient-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner.</a> Nat Commun. 14 (1), 506(2023).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> J Transl Med. 8 (104), (2010).</li>
<li>Xu, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+comparative+analysis+reveals+differential+impacts+of+various+cytokines+on+CART+cell+phenotype+and+function+ex+vivo+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo.</a> Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).</li>
<li>Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-cell+growth+by+IL-2+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15.</a> Blood. 108 (2), 600-608 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+in+vitro-transcribed+mRNA+in+adoptive+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy.</a> Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).</li>
<li>Becker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+effectiveness+of+gammadelta+T+cells+by+mRNA+transfection+of+chimeric+antigen+receptors+or+bispecific+T+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers.</a> Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).</li>
<li>Wiesinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-scale+production+of+CAR-T+cells+for+the+treatment+of+melanoma+patients+by+mRNA+transfection+of+a+CSPG4-specific+CAR+under+full+GMP+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).</li>
<li>Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+meets+mRNA+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology.</a> Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).</li>
<li>Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics--developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Underwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activators+exhibit+distinct+downstream+effects+on+chimeric+antigen+receptor+T+cell+phenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function.</a> Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).</li>
<li>Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+stability+analysis+of+yeast+displayed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins.</a> Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).</li>
<li>Seigner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+mystery+of+the+FMC63-CD19+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity.</a> Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).</li>
<li>Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+and+implications+of+mRNA+poly%28A%29+tail+size--does+this+protein+make+my+tail+look+big%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big.</a> Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+encoding+a+chimeric+antigen+receptor+is+critical+for+the+generation+of+a+robust+T-Cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response.</a> Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-mRNA+for+transient+CAR+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation.</a> Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).</li>
<li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+approach+to+generate+transient+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+mRNA+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy.</a> J Vis Exp. (216), e67548(2025).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+mRNA+CAR+T+cells+targeting+GD2+provide+dose-adjusted+efficacy+against+diffuse+midline+glioma+and+high+grade+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models.</a> Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).</li>
<li>Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay+to+assess+chimeric+antigen+receptor+T+cells+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level.</a> J Vis Exp. (217), e67657(2025).</li>
<li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+cytotoxicity+evaluation+of+Jurkat+expressing+chimeric+antigen+receptor+using+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging.</a> J Vis Exp. (200), e65560(2023).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+primary+human+and+mouse+T+lymphocytes+using+RNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation.</a> Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Clausen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+activation-associated+receptors+CD25+and+CD69+on+human+NK-cells+and+NK-like+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells.</a> Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).</li>
<li>Poloni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation-induced+marker+assays+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell activation-induced marker assays in health and disease.</a> Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).</li>
<li>Rotta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+flow+cytometry+immunophenotyping+of+human+antigen-specific+T+cells+by+activation-induced+marker+and+Th1+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).</li>
<li>Elsallab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+primary+malignancies+after+commercial+CAR+T-cell+therapy%3A+analysis+of+the+FDA+adverse+events+reporting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system.</a> Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).</li>
<li>Verdun, N., Marks, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+cancers+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy.</a> N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).</li>
<li>Krug, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+activity+of+MCSP-specific+chimeric+antigen+receptors+%28CARs%29+depend+on+the+scFv+antigen-binding+domain+and+the+protein+backbone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone.</a> Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+outperform+electroporation+in+mRNA-based+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).</li>
<li>Sauerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mRNA+as+a+universal+technology+platform+to+transfect+a+variety+of+primary+cells+with+antigens+and+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins.</a> Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).</li>
<li>Bimbo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-specific+non-viral+DNA+delivery+and+in+vivo+CAR-T+generation+using+targeted+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles.</a> J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Prommersberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircles+for+CAR+T+cell+production+by+sleeping+beauty+transposition%3A+a+technological+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview.</a> Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).</li>
<li>Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-Transcribed+mRNA+chimeric+antigen+receptor+T+cell+%28IVT+mRNA+CAR+T%29+therapy+in+hematologic+and+solid+tumor+management%3A+A+preclinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).</li>
<li>Granit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+activity+of+autologous+RNA+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+in+myasthenia+gravis+%28MG-001%29%3A+a+prospective%2C+multicentre%2C+open-label%2C+non-randomised+phase+1b%2F2a+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study.</a> Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).</li>
<li>Dagher, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+efficacy+of+multi-targeting+mRNA-based+CAR+T+cell+therapy+in+resection+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes, High Performance</td><td>VWR</td><td>525-1164</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates, flat bottom, TC-treated</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD staining solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-568</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag DYKDDDDK Antibody, APC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-119-584</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Clinical Flow Cytometry System</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Merck</td><td>A4503-10G</td><td>Gravity flow isolation için</td></tr><tr><td>CD134 (OX40) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-048</td><td>Konjugat: PE</td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-764</td><td>Konjugat: APC</td></tr><tr><td>CD154 (CD40L) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-142</td><td>Konjugat: PerCP-VIO 700</td></tr><tr><td>CD25 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-541</td><td>Konjugat: PE-Vio 770</td></tr><tr><td>CD3 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-352</td><td>Konjugat: PE-Vio 670</td></tr><tr><td>CD4 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-223</td><td>Konjugat: APC-Vio 770</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>Gravity flow isolation için</td></tr><tr><td>CD45 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-775</td><td>Konjugat: VioBlue</td></tr><tr><td>CD45RA Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-270</td><td>Konjugat: Vio Bright V600</td></tr><tr><td>CD62L Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-499</td><td>Konjugat: Vio Bright R720</td></tr><tr><td>CD69 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-800</td><td>Konjugat: VioGreen</td></tr><tr><td>CD8 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-677</td><td>Konjugat: FITC</td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td>Gravity flow isolation için</td></tr><tr><td>Cellstar 96 Well Suspension Culture Plate, U-bottom</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator ICO150</td><td>Memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>CoolNat Ice Machine</td><td>Ziegra Eismaschinen GmbH</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning CoolCell Freezer Container</td><td>Corning</td><td>CLS432000</td><td></td></tr><tr><td>Counting chamber, Bürker-Türk pattern, BLAUBRAND</td><td>Brand</td><td>719520</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure tubes, 2 mL, QuickSeal screw cap</td><td>Sarstedt</td><td>72.380</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX LX Flow Cytometer</td><td>Beckmann Coulter</td><td>C11185</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture grade</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes with 4 mm gap size, yellow cap</td><td>VWR</td><td>732-1137</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 0.1&ndash;2.5 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 100&ndash;1000 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 2&ndash;20 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 20&ndash;200 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck</td><td>E6758-100G</td><td>Gravity flow isolation için</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>325098</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Value FBS</td><td>Gibco</td><td>A52567-01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375-10G</td><td>Density gradient isolation için</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Sterile Graduated Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13469108</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>PC Module ve CE Module ile</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)</td><td>New England Biolabs</td><td>E2060S</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-15, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-955</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-7, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-367</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp;PIPETBOY acu 2 pipet aid</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085685</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Gravity flow isolation için</td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, PS, V-bottom, clear, non-binding</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651901</td><td></td></tr><tr><td>Monarch RNA Cleanup Kit (50 &mu;g)</td><td>New England Biolabs</td><td>T2040S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Spin PCR &amp; DNA Cleanup Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>T1130S</td><td></td></tr><tr><td>

birincil insan t hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici transfeksiyonu için kimerik antijen reseptörü (car) t hücreleri üretmek

Isolation, Cultivation, and Transient Transfection of Primary Human T Cells to Generate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

Birincil insan T hücrelerinin aktivasyonu ve genişlemesi Birincil T hücreleri 0. günde CD3/28 boncukları veya TransAct ile eritilip aktive edildi, 23 gün genişletildi ve her 2-3 günde bir sayıldı (Şekil 2A). Sayım günlerinde, hücre yoğunlukları 0,3-0,5 x 106 hücre/mL olarak ayarlandı. 0/2/5/9/14/20 günlerinde, aktivasyon belirteçlerinin fenotipi ve ekspresyonu değerlendirmek için akış sitometrik analizinde T hücreleri kullanıldı. Aktivasyondan sonraki ilk hafta içinde, T hücreleri her iki aktivasyon reaktifiyle birlikte hızla çoğaldı ve genişledi (Şekil 2B), sonraki günlerde TransAct ile aktive edilen T hücrelerinde ise biraz daha düşük katlanma genişlemesi yaşandı (Şekil 2C). Özellikle, T hücrelerinin aktivasyonu mikroskobik analizle de görülebiliyordu; aktivasyon reaktiflerinin etrafında T hücresi kümeleri oluşuyordu (Şekil 2D).
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Şekil 2: İki farklı aktivasyon reaktifiyle birincil T hücrelerinin aktivasyonu ve genişlemesi. (A) Deneysel zaman çizelgesinin şematik temsili. Hücreler 0. günde CD3/28 boncukları veya TransAct ile aktive edildi ve 23 gün boyunca kültürlendi. Mavi noktalar hücrelerin sayıldığı günleri, kırmızı noktalar hücrelerin akış sitometrisiyle analiz edildiği günleri, mor noktalar ise her iki analizin de yapıldığı günleri gösterir. (B) ve (C) Kültürden sonraki ilk hafta (B) veya (C) içinde primer T hücrelerinin genişlemesi. Değerler, 4 (CD3/28 boncuk) veya 3 (TransAct) farklı sağlıklı T hücresi bağışçısının ortalama ± standart sapmasını gösterir. (D) Aktivasyondan sonraki 1. ve 2. günlerde görünür hücre kümelenmesi olan aktive T hücrelerinin temsil mikroskobik görüntüleri. Görüntüler ters mikroskopla çekildi. Cetvel 200 μm'ye karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
T hücresi fenotipinin boyalanması ve aktivasyon belirteçleri Akış sitometrik analizi için aşağıdaki kapı stratejisi uygulandı (Şekil 3): Hücre kalıntıları ve boncukları çıkarmak için ilk kapı (FSC-Yükseklik vs. SSC-Yükseklik) uygulandı, ardından tek hücreler için kapı (FSC-Genişlik vs. SSC-Alan) uygulandı. CD3+ hücrelerinin oranı %98-100 aralığında olmalıdır. Daha fazla alt kapı ile CD4+ (yardımcı) T hücreleri ve CD8+ (sitotoksik) T hücrelerinin yüzdesi elde edildi; bunlar CD45RA ve CD62L belirteçleri kullanılarak farklı fenotipik T hücre alt kümeleri için daha fazla kapatıldı. CD3+ T hücreleri, aktivasyon belirteçlerinin (CD25/CD69/CD134/CD137/CD154) ekspresyonu açısından ek olarak analiz edildi.
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Şekil 3: Akış sitometrik analizi için kapı stratejisi. 5. günde CD3/28 boncuklarıyla aktive edilen bir T hücresi donörünün temsilci nokta grafikleri gösterilir (n = 4). Kısaltmalar; TEMRA = CD45RA'yı yeniden ifade eden T efektör bellek hücreleri; TSCM = kök hücre benzeri hafıza T hücreleri; TEM = efektör bellek T hücreleri; TCM = merkezi bellek T hücreleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
CD3/28 boncuklarla aktivasyondan sonra, CD4+ T hücrelerinin CD8+ T hücrelerine kıyasla oranı zamanla azaldı; 5. günde CD4+ T hücrelerinin %74,3'ü (± %7,4) bulundu; aktivasyondan sonraki 20. günde %14,6'ya (± %3,4) düştü. CD8+ T hücreleri 5. günde %20,7'den (%6,4± %20'ye (%82,4) (± %3,1) yükseldi (Şekil 4A). TransAct ile aktivasyondan sonra benzer eğilimler tespit edildi; 20. günde CD8+ T hücrelerinin oranı biraz daha düşük oldu (%72,5 ± %0,7). Bu nedenle, TransAct ile aktivasyondan sonra gözlemlenen biraz daha yavaş T hücresi genişlemesi, genleşme döneminde CD8+ oranının daha düşük ve CD4+ hücrelerinin daha yüksek yüzdesine karşılık geldi. T hücresinin fenotipik bileşimindeki farklar her iki aktivasyon reaktifinde de benzerdi (Şekil 4B). Ancak, CD45RA (TEMRA) yeniden ifade eden T efektör bellek hücrelerinin sıklıkları, CD8+ hücreler için CD4+ hücrelerine göre genel olarak daha yüksekti. Aynı şekilde, CD4+ T hücrelerinde merkezi hafıza T hücreleri (TCM) ve kök hücre benzeri bellek T hücreleri (TSCM) oranlarında daha yüksek oranlar bulundu (Şekil 4B).
CD134, T hücrelerinin eritilmesinden sonra zaten yukarı regülasyona sahip olan tek aktivasyon belirteciydi; %37,6 (%± %4,1) CD134+ T hücreleri CD3/28 boncuklarla aktive edildi ve %36,1 (±%4,4) %4,4 CD134+ T hücreleri TransAct ile aktive edilmiş T hücreleri için (Şekil 4C). Her iki aktivasyon stratejisinde de, CD25, CD69 ve CD134 2. güne kadar yüksek regulasyonda gerçekleşti. CD3/28 boncuklarında ise CD69 ve CD134 ifadesi 2. günde zirveye ulaşırken, CD25 5. günde zirveye ulaştı. Benzer sonuçlar TransAct ile aktifize edilmiş T hücreleri için de görüldü. CD134 ve CD154, hem CD3/28 boncukları hem de TransAct ile aktifleşmiş hücreler için yalnızca 14. günde yukarı regülasyon yapıldı. Genel olarak, gözlemlenen eğilimler iki aktivasyon reaktifi arasında çok benzerdi. Ancak, 14. gündeki CD69 ekspresyonu, CD3/28 ile aktive edilen T hücrelerinde TransAct muadillerine göre biraz daha yüksekti (%97,1 %± %0,9 ± %86,5 %5,1). Bu, CD3/28 boncukla aktive edilen hücrelerde görülen uzun süreli yüksek genleşme hızına karşılık gelir. Özetle, önerilen aktivasyon belirteç paneli, aktivasyondan sonra erken ve sonraki zaman noktalarında yukarı düzenlenen işaretleyicileri içerir; farklı aktivasyon belirteçleri arasında duyarlılık değişir, ancak genel olarak her iki aktivasyon reaktifi için benzer eğilimler vardır.
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Şekil 4: 20 günlük bir yetiştirme süresinde farklı aktivasyon reaktifleriyle T hücresi fenotipi ve aktivasyon belirteci ekspresyonunun analizi. (A) CD3/28 boncukları (solda) veya TransAct (sağda) ile aktivasyondan sonra yetiştirme sırasında CD4+/CD8+ T hücrelerinin yüzdeleri. (B) CD3/28 boncukları (iki sol panel) veya TransAct (iki sağ panel) ile aktivasyondan sonra T hücresi farklılaşması, her biri CD4+ veya CD8+ hücreleri için. Fenotip, CD45RA ve CD62L belirteçleri kullanılarak değerlendirildi. TEMRA: CD45RA+ CD62L-, TEM: CD45RA- CD62L-, TCM: CD45RA-CD62L+, TSCM: CD45RA+ CD62L+. (C) CD3/28 boncukları veya TransAct ile aktivasyondan sonra ve genleşme döneminde aktivasyon belirteçlerinin ifadesi. Ebeveyn popülasyonu CD3+ T hücrelerinin frekansları [%] gösterilmiştir (ortalama 4 [CD3/28 boncuk] veya 3 farklı sağlıklı T hücre bağışçısının standart sapması ± ortalama). Kısaltmalar; TEMRA = CD45RA'yı yeniden ifade eden T efektör bellek hücreleri; TSCM = kök hücre benzeri hafıza T hücreleri; TEM = efektör bellek T hücreleri; TCM = merkezi bellek T hücreleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Birincil T hücrelerinin geçici transfeksiyonu ve CAR ekspresyonunun analizi Birincil T hücreleri, aktivasyondan sonra 7. gün elektroporasyon yoluyla CD3/28 boncukları veya TransAct ile mRNA ile transfekte edildi. Bir şablon olarak, ikinci nesil CAR için kodlayan mRNA, kondroitin sülfat proteoglikan 4 (CSPG4) için CD28 ko-uyarıcı ve CD3ζ sinyal alanı ile kullanıldı. Akış-sitometrik algılamayı mümkün kılmak için bir DYKDDDDK-etiketi (bayrak etiketi) eklendi. T hücresi canlılığı ve CAR ekspresyonu elektroporasyondan 3, 6, 24 ve 48 saat sonra değerlendirildi. Boyama, protokol 6. bölümünde tanımlandığı gibi yapıldı.
CD3/28 boncuk ve TransAct ile aktive edilen T hücrelerinin canlılığı elektroporasyondan 3 saat sonra düşük olsa da, genel olarak transfekte edilen CAR T hücrelerinin canlılığı %51-85 arasında değişmiş ve iki aktivasyon stratejisi arasında anlamlı bir fark yaşamazmıştır (Şekil 5A). CAR, elektroporasyondan sonra bu erken noktada zaten tespit edilebiliyordu. CAR+ hücrelerinin yüzdesi zamanla azalsa da, CAR+ hücrelerinin en yüksek frekansı elektroporasyondan sonraki 24 saat içinde tespit edilebiliyordu (Şekil 5B, sol panel). Özellikle, sinyal yoğunluğu elektroporasyondan sonraki ilk 6 saat içinde stabildi ve sonrasında kademeli olarak azaldı (Şekil 5B, sağ panel). CAR ifadesi 48 saat sonra neredeyse yoktu; bu da hücre manipülasyonunun geçici doğasını ve aşağı akış testleri için erken zaman aralığı seçmenin önemini gösterdi. Bir donörün CAR ifadesi için temsil nokta grafikleri Şekil 5C'de gösterilmiştir. Her iki aktivasyon reaktifi için, CD4/CD8 oranı CAR ile MOCK transfekte edilmiş hücreler arasında farklı olmamıştır (Şekil 5D). Önceki sonuçlarımızla tutarlı olarak, CD3/28 boncuklarıyla aktive edilen T hücreleri, TransAct ile aktive edilen hücrelere göre CD8+ T hücrelerinin biraz daha yüksek bir sıklığına sahip olduğunu gösterdi. Fenotipik analiz için, büyük donör bağımlı varyasyonlar nedeniyle bir temsilci donör gösterilmiştir (Şekil 5E). Hem aktivasyon reaktifi hem de CD4/CD8 durumu T hücresi fenotipini etkilerken, CAR ekspresyonu MOCK transfekte edilen hücrelere kıyasla fenotipte değişiklik yapmaz.
mRNA konsantrasyonunun ifade seviyeleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için, birincil T hücreleri, 0.1, 0.3, 1, 3 veya 6 μg mRNA kullanılarak mutant bir GFP (muGFP) için mRNA kodlayan mRNA ile transfekte edildi. GFP sinyali, elektroporasyondan 24 saat sonra akış sitometrisiyle ölçüldü. Beklendiği gibi, zaten 0.1 μg kadar az miktarda mRNA tespit edilebilir bir GFP sinyaline yol açtı ve mRNA miktarları arttıkça sinyal yoğunluğu kademeli olarak arttı. Deneylerimizde, 1 μg mRNA zaten doygunlaşmıştı ve daha büyük miktarlar (3 ve 6 μg mRNA) GFP sinyalinin artmasına yol açmadı (Şekil 5F). Bu, farklı CAR veya hedef antijen ekspresyon seviyelerinin etkisini test etmek için farklı miktarlarda mRNA kullanma olasılığını ortaya koymaktadır; bu da farklı CAR veya hedef antijen ifadeseviyeleri 28'in etkisini test etmek için faydalı olabilir.
<img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Şekil 5: CAR'ların ekspresyon kinetiği ve transfekte edilen CAR T hücrelerinin fenotip analizi. (A) CAR kodlayan mRNA ile elektroporasyon sonrası CAR T hücrelerinin yaşamı. 100 μL boyama tamponunda 2 μL 7-AAD, 10 dakikalık kuluçkadan sonra canlılığı değerlendirmek için kullanıldı. n = 2-3 bireysel bağışçı (B) CAR ekspresyonu için anti-DYKDDDDK antikoru ile boyama (APC ile konjuge edilmiş, 1:50 nihai seyreltme). Canlı hücrelerde kapı açıldıktan sonra, MOCK transfekte edilen kontrollerle (sol panel) karşılaştırıldığında CAR-pozitif hücrelerin yüzdesi veya tüm popülasyonun geometrik medyan floresans yoğunluğu (GeoMean, sağ panel) analiz edildi. Gösterilen, n = 3 bireysel bağışçının ortalamaları ± S.D. (C) (B)'den bir bağışçının temsil nokta grafikleri, CAR ifadesinin zaman içindeki kinetiklerini göstermektedir. (D) CD4+/CD8+ T hücrelerinin analizi ve MOCK ile CAR transfekte edilen T hücrelerinin ve elektroporasyondan 24 saat sonra iki farklı aktivasyon stratejisinin karşılaştırılması. Gösterilen ortalamalar n = 3 bireysel bağışçı ± S.D. (E) (B)'de elektroporasyondan 24 saat sonra MOCK transfekte edilen ve CAR transfekte edilen T hücrelerinin fenotipik analizidir. Gösterilen, n = 3 değerinde bir temsilci bağışçı gösterilmiştir. (F) Farklı mRNA miktarlarında elektroporasyondan 24 saat sonra muGFP ifadesinin analizi. Canlı hücreler için kapı belirleme, GFP için GeoMean nicelendirilmeden önce gerçekleştirilmiştir. Gösterilen n = 3 bağışçı ± S.D. Kısaltmaları; CAR = kimerik antijen reseptörü; mRNA = haberci ribonüklein asidi; 7-AAD = 7-aminoaktinomisin; RT = oda sıcaklığı; muGFP = mutant yeşil floresan protein; S.D. = standart sapma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Birincil insan T hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici transfeksiyonu için kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri üretmek

To assess the efficacy and potency of chimeric antigen receptor (CAR) T cells, it is essential to isolate, activate, expand, characterize, and genetically ...

isolation-cultivation-transient-transfection-primary-human-t-cells-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin ex vivo üretilmesi için kullanılan bir teknik gösterilmektedir. İnsan T hücreleri, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile kaplanmış manyetik boncuklar ve interlökin-2 (IL-2) ile takviye edilmiş bir ortam ile inkübe edilir ve bu da T hücresi aktivasyonuna ve çoğalmasına yol açar. Transgenik RNA'nın konakçı genomuna entegre olmasına ve transgeni eksprese etmesine izin veren transgenik lentiviral vektörler tanıtılır. Bu, transdüksiyona...

Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Üretmek için Ex Vivo Bir Teknik

Bu videoda, tümör antijenine özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin ex vivo üretimi için bir teknik gösterilmektedir. Transgenik RNA taşıyan retroviral vektörler, T hücresi sağkalımını ve proliferasyonunu teşvik etmek için interlökin-2 ile takviye edilmiş bir ortamda dalak hücreleri ile karıştırılır. Karışım daha sonra rekombinant insan fibronektin fragmanları ile kaplanmış bir plakaya aktarılır ve virüsün hücre ile füzyonunu kolaylaştırmak için santrifüjlenir, bu da RNA'nın...

Tümöre özgü kimerik antijen reseptör T hücreleri oluşturmak için bir ex vivo teknik

Bu video, retroviral transdüksiyon yoluyla antijene özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için bir tekniği göstermektedir. Aktive edilmiş murin CD8 + T hücreleri, rekombinant fibronektin fragmanları ile kaplanmış bir mikrokuyu plakasına eklenir. Antijene özgü bir kimerik antijen reseptörünü (CAR) kodlayan transgenik RNA içeren retroviral vektörler daha sonra sokulur ve transdüksiyonu kolaylaştırmak için plaka santrifüjlenir. İnkübasyondan sonra, transdüksiyon hücreleri...

Antijene Özgü CAR T Hücrelerinin Üretilmesi için Bir Teknik

Biz güvenilir şemerik antijen reseptörü oluşturmak için bir yaklaşım tarif (CAR) T hücreleri ve in vitro ve in vivo onların farklılaşma ve fonksiyon test.

İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri

Bu makale, klinik kullanım için kimerik antijen reseptörü T hücreleri için, özellikle viral transdüksiyon ve T hücrelerinin kültivasyonunu gerçekleştirebilen otomatik bir hücre işlemcisi kullanarak üretim sürecini detaylandırmaktadır. Erken aşama bir klinik araştırmanın süreç geliştirme ve uygulaması sırasında göz önünde bulundurulması gereken önerilerde bulunuyor ve tuzakları açıklıyoruz.

Otomatik Hücre İşlemcisinde Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi Üretimi

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Bu protokol, kanser immünoterapisi için entegre olmayan mRNA kullanarak geçici kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için ayrıntılı bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir ve CAR-T hücrelerini ve sitotoksik işlevlerini değerlendirmek için güvenilir yöntemler sağlar.

Kanser İmmünoterapisi için mRNA Kullanarak Geçici Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Oluşturmak İçin Viral Olmayan Bir Yaklaşım

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Homoloji aracılı uç birleştirme (HMEJ) DNA onarım yolu yoluyla birincil insan T hücrelerinde büyük, multisistronik yapıların yüksek verimli hedefli knock-in'ini elde etmek için CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu cGMP'ye uyarlanabilir protokolle tasarlanan T hücreleri, mükemmel hücre genişlemesi, sitotoksisite ve sitokin üretimini korur.

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği

Öğrenin, birincil insan T hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici mRNA elektroporasyonu ile kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri üretme yöntemini. Bu protokol hızlı CAR yapısı taraması ve fonksiyonel analiz için esnek bir yaklaşım sunar.

Birincil insan T hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici transfeksiyonu için kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri üretmek (Video) | JoVE Journal

Birincil insan T hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici transfeksiyonu için kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri üretmek

Daha fazla video keşfet