Fare Hipokampusunda Kalın Dokular İçin Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışı Gösterildi
27 Mart 2026
Bu protokol, kalın dokular için kriyo-elektron tomografisini (kriyo-ET) standartlaştırır; yüksek basınçlı dondurma (HPF) ile waffle yöntemi, kriyojenik odaklı ion ışını (kriyo-FIB) kaldırma ve doz-simetrik, paralel alım ile entegre edilir; böylece fare hipokampusunda tekrarlanabilir in situ analizi için uniform ince lameller ve vitrifikasyon örnekler elde edilir.
Araştırmam, fare hipokampusu gibi kalın dokuların yerinde yapısal analizini mümkün kılan standartlaştırılmış bir kriyo-ET iş akışı kurmaya odaklanıyor. Mevcut yöntemler kalın dokular için güvenilirliksizdir, bu nedenle bu protokol standartlaştırılmış analiz için optimize edilmiş adımları entegre eder. Başlamak için, temiz bir cam yüzeye 10 L'lik %10 sakaroz çözeltisi damlası koyun.
Yeni ötenazi edilmiş bir farenin hipokampusunu hızla disseksiye et. Keskin bir jilet kullanarak, 0,5 ila 1 milimetreküp küçük doku parçalarını kesin. Bir kürdan veya ince fırça kullanarak, dokuyu yüksek basınçlı dondurucu taşıyıcı içindeki hazırlanmış bakır destek TEM ızgaralarına aktarın.
Dokunun nemli kalması ve ızgaradaki konumunu ayarlamak için 2-metilpentan kullanın; mekanik stresi en aza indirerek ızgara hasarını önleyin. Sonra, doku ve ızgarası 3 milimetre çapında bakır folyo diskle kaplayın. Montajı tamamlamak için, ikinci yüksek basınçlı dondurucu taşıyıcıyı düz yüzü aşağı konumda üst üste koyarak mühürlenmiş bir waffle sandviçi oluşturun.
Ve donma parametrelerini kontrol ederek cihazda herhangi bir anormallik olmadığından emin olun. Doku diseksiyonundan donmaya kadar toplam sürenin 90 saniyeyi geçmediğinden emin olun. Kaldırma işlemi için son alıcı ızgarası olarak hizmet edecek yeni bir 300 ağlık altın ızgara edinin.
Oda sıcaklığında stereo mikroskop altında, ızgarası uyumlu bir kriyo-FIB AutoGrid halkası ile nazikçe kesin. Daha sonra, birleştirilmiş AutoGrid'i doğrudan yaklaşık 40 derece Celsius sıcaklığında tutulan kuru bir fırında saklayarak don birikmesini en aza indirmek için kullanın. Montajı sürekli sıvı azotla batırırken, vitrifikasyon TEM ızgarasını çevresindeki waffle montaj bileşenlerinden dikkatlice ayırın.
Önceden soğutulan, ince uçlu cımbız kullanarak, iki yüksek basınçlı dondurucu taşıyıcıyı nazikçe ayırın. Sonra, önceden soğutulan bir kriyo-yükleme iş istasyonunda, izole doku ızgarasını sıvı azot koruması altında ikinci bir kriyo-FIB AutoGrid halkasına monte eder. Her iki AutoGrid'i kriyo-transfer mekiği örnek tutucusunun belirlenmiş yuvalarına yükleyin.
Her AutoGrid'i, freze çentikinin dışa bakacak şekilde ve daha düşük frezeleme açısı için dikey konumlandırılacak şekilde yönlendirin. Tam yüklü mekiği sıvı azotta batırılmış veya önceden soğutma halinde tutun, ta ki FIB-SEM'e aktarılana kadar. Örnek aşamasını örnek çubuğu kullanarak enstrümana yükleyin.
Mikroskopa kriyo-transferden sonra, düşük SEM büyütme ile doku ızgarasına gidin. Sonra, iletken koruma sağlamak için ızgara yüzeyini 30 miliamper sıcaklıkta platinle 15 saniye boyunca sputter ile kaplayın. Gaz enjeksiyon sistemi ile yaklaşık 60 saniye boyunca 0,5 ila 1,0 mikrometre kalınlığında organometalik platin kapağını bırakın.
Son sputter kaplamalı platin tabakasını ızgara yüzeyine 30 miliamper sıcaklıkta 15 saniye boyunca uygulayın. SEM elektron ışını görüntüsünü kullanarak doku ızgarasında seçilen ilgi alanına gidin. Numuneyi ön taraf frezeleme için yönlendirmek için, aşamayı yaklaşık 110 derece dönüş ve 7 derece eğime ayarlayarak örnek yüzeyini iyon ışınına erişim için uygun bir açıda sunun.
Hendek frezeleme için, hedef doku bloğunu çevreleyen dikdörtgen bir hendek tanımlayın ve 30 kilovoltta çalışan iyon ışını kullanılır. Hızlı malzeme çıkarımı sağlamak için bloktan uzakta frezelemeye başlayın, böylece 15 nanoamper gibi nispeten yüksek bir akım kullanılır. Hendek duvarları bloka birkaç mikrometre yaklaştıkça, iyon ışını akımını 7 nanoampre düşürerek daha hassas frezeleme kontrolü sağlanır.
Blokun bir tarafını toplu malzemeye bağlı bırakarak geçici bir tutma sekmesi oluşturun. Tahmini kalınlığı 20 mikrometreden fazla olan doku blokları için, son kaldırmayı kolaylaştırmak için ters taraftan alt kesim frezeleme adımı gerçekleştirilin. Sahneyi döndürün ve eğimi blokun altına ulaşmak için ayarlayın.
Alt taraf bağlantısını odaklı iyon ışını kullanarak 30 kilovolt ve 3 nanoamper akımda frezeleyin. Metal bloğun altını örnek bloğa sıkıca oturacak şekilde öğütün. Numune ile altın bloğu arasındaki temas yüzeyini hassas frezeleme ile teması daha sıkılaştırın.
Örneği iğneye bağlamak için, altın bloğun hedef numuneyle doğrudan temas halinde olduğundan emin olun. 30 kilovolt ve 0,5 nanoamper odaklı iyon ışını kullanarak, altın bloğu numuneye kaynatmak için arayüzde 8 ila 12 ardışık kesit frezeleme desenleri yapılabilir. Doku bloğunu kaldırmak için, bloğu toplu numuneye bağlayan kalan sekmeyi odaklı iyon ışını ile kesin.
Mikromanipülatör iğnesini dikkatlice hareket ettirerek izole doku bloğunu hendek ve çevresindeki ızgaradan tamamen kaldırın. İğneyi geri çekin ve bloğu alıcı ızgarasına taşıyın. Mikromanipülatör iğnesini önceden soğutmalı 300 mesh altın alıcı ızgarasına yönlendirin.
Bloğu seçilmiş bir ızgara kareye indirin. Şebekeye küçük buz kristallerini öğüterek doku bloğu ve ızgaranın daha sıkı yapışmasını sağlayın. Doku bloğunu öyle aşağı indirin ki sadece ızgaraya temas etsin.
Bloktan 3 ila 4 mikrometre kalınlığında bir dilim iyon ışını kullanarak ızgara filmine freze yapın. Sonra, birleşimin her iki tarafında temizleyici kesit desenleri kullanarak frezeleme ile kesimi sağlam bir şekilde kaynak yapın ve daha önce gösterildiği gibi iletken ve koruyucu kaplamayı ızgara yüzeyine yeniden uygulayın. Lamel inceltme için, aşama eğimi ayarlandıktan sonra, doku bloğunun düzgün bir alanında son lamella pozisyonu tanımlanır.
Sunulan tabloda belirtilen iyon ışını akımları ve aşırı eğilme telafileri kullanarak sistematik frezeleme gerçekleştirin. Lamelin 1 ila 2 mikrometre yakınında, isteğe bağlı olarak yaklaşık 1,5 mikrometre mesafede bir stres giderici hendek freze ederek lamelanın bükülmesini veya kıvrılmasını önleyin. Lamella hazırlandıktan sonra, kriyoelektron mikroskopi ile görüntüler alın.
Waffle yöntemiyle yüksek basınçlı dondurma ile işlenen doku blokları uniform ve elektron şeffaf bir görünüm sergiliyordu. Rekonstrüksiyon yapılan tomogramlar, hücresel ortamdaki mitokondriyal yapıları çözmüştür. Ribozomlar gibi makromoleküler kompleksler sitoplazmada net şekilde çözülmüştür.
Yeniden oluşturulan tomogramlarda sitoskelet ve zarla ilişkili hücresel özellikler ile çekirdek gözenek kompleksleri de görülüyordu. Kalsiyum depoları ve miyelin kılıfı yapıları gibi sinaptik yapılar ve özellikler tomogramlarda açıkça görüldü. Bu protokol, araştırmacıların karmaşık doku ortamlarında doğrudan doğal hücresel dış yapıyı incelemelerini sağlar.
Bu kriyo-ET protokolündeki en kritik zorluk, kalın doku örneklerinin tekdüze, artefaktsız vitrifikasyonunu sağlamaktır. Bu prosedürün ardından araştırmacılar, ilgi gören bölgeleri korelasyon ışık ve elektron mikroskobu veya etiketleme teknikleriyle konumlandırabilir, ardından makromoleküler kompleksleri çözmek için sub-tomogram ortalaması ve yapı analizi yapabilirler.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Overview
This article presents a comprehensive, standardized workflow for cryo-electron tomography (cryo-ET) of thick tissue samples, specifically demonstrated on mouse hippocampus. The protocol integrates rapid high-pressure freezing, precise cryo-focused ion beam (cryo-FIB) milling, and advanced imaging and data processing steps to enable high-resolution, in situ structural analysis of native cellular environments within complex tissues.
Key Study Components
Area of Science
- Structural biology
- Cryo-electron microscopy
- Tissue ultrastructure analysis
Background
- Cryo-ET allows 3D visualization of cellular ultrastructure in a near-native state.
- Application to thick tissues is limited by challenges in vitrification and lamella preparation.
- Existing protocols often lack reproducibility and throughput for complex tissue samples.
- Reliable workflows are needed for in situ analysis of macromolecular complexes within tissues.
Purpose of Study
- To establish a reproducible, end-to-end cryo-ET workflow for thick tissue samples.
- To optimize vitrification and lamella preparation for high-quality imaging.
- To enable high-throughput, artifact-free structural analysis of native tissue environments.
Methods Used
- Rapid dissection and high-pressure freezing (HPF) of tissue using a "waffle" assembly with copper foil.
- Transfer and mounting of tissue onto TEM grids, followed by vitrification within 90 seconds of dissection.
- Cryo-FIB milling for lift-out and thinning of tissue blocks to 120–200 nm lamellae, with over-tilt compensation and stress-relief trenching.
- Standardized conductive coating using sputter platinum and gas injection system (GIS) platinum cap.
- Automated, dose-symmetric tilt-series acquisition using PACEtomo scripts.
- Data processing with AreTomo 3 for motion correction, CTF estimation, alignment, and WBP reconstruction; optional IsoNet for missing-wedge correction.
- Subtomogram averaging and resolution assessment using RELION 4.0.
Main Results
- The workflow consistently produces well-vitrified, uniform lamellae (target thickness 150 ± 40 nm).
- High-throughput tilt-series collection is achieved (typically 5–8 minutes per tilt series).
- Reconstructed tomograms resolve key cellular structures, including mitochondria, ribosomes, cytoskeletal elements, nuclear pore complexes, synaptic features, calcium stores, and myelin sheaths.
- The protocol enables direct visualization and analysis of macromolecular complexes in situ within thick tissue samples.
Conclusions
- This standardized protocol overcomes major challenges in cryo-ET of thick tissues, particularly vitrification and lamella preparation.
- It provides a reproducible, high-throughput route for in situ structural biology studies in complex tissue environments.
- The workflow facilitates detailed analysis of native cellular architecture and macromolecular assemblies directly from tissue.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
High-resolution, in situ structural analysis of thick tissue samples is a critical bottleneck in early discovery and translational research. This standardized cryo-electron tomography (cryo-ET) workflow enables reproducible, artifact-minimized visualization of native cellular architecture directly from complex tissues, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The protocol's throughput and reliability position it as a foundational capability for enterprise-scale structural biology and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of macromolecular complexes within native tissue environments.
- Supports mechanistic de-risking by resolving cellular ultrastructure relevant to disease pathways.
- Facilitates functional target validation through high-fidelity visualization of subcellular features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by minimizing sample preparation artifacts.
Screening & Assay Development
- Prepares uniform, electron-transparent lamellae suitable for downstream high-throughput imaging workflows.
- Standardizes sample preparation to ensure reproducibility and quantitative comparability across experiments.
- Enables reliable assessment of compound effects on tissue ultrastructure in screening campaigns.
- Supports platform scalability and reuse for diverse tissue types with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural readouts with disease-relevant tissue models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical validation in complex tissues.
- Reduces risk of late-stage biological failure by enabling early detection of ultrastructural phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on direct visualization of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust, high-throughput structural analysis of thick tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of native macromolecular assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative lamellae preparation for reliable downstream imaging and analysis.
- Analytics: Provides high-resolution tomograms and subtomogram averages for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease-relevant model validation using in situ tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized protocol adaptable across tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sample preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM, cryo-FIB milling, and high-pressure freezing instrumentation.
- Demands access to advanced analytical infrastructure for automated tilt-series acquisition and data processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, vitrification, and lamella preparation protocols.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of dissection and freezing parameters.
- Uniform vitrification and artifact minimization are critical for reproducible, high-quality outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
High-Pressure Freezing of Thick Tissue for Cryo-Electron Tomography
1:44
Preparation of Receiver and Tissue Grids for Cryo-FIB Lift-Out
4:08
Tissue Block Isolation and Lift-Out
6:56
Block Attachment to the Receiver Grid
7:49
Lamella Thinning
8:36
Results
9:23
Conclusion
