Nanopore dizileme tabanlı iş akışları kullanarak uzun okuma plazmid dizileme ve montajı
July 7th, 2026
Mevcut çalışma, kromozom dizisi zaten biliniyor veya ilgi çekici olmayan plazmidlerin nanopore dizileme iş akışını açıklıyor. Başlangıçta bir plazmid DNA zenginleştirme adımı, optimal plazmid dizisi derinliğini sağlar ve akış hücresi başına dizilenebilen örnek sayısını maksimize eder.
Plasmitler olarak bilinen, kendini çoğaltan dairesel DNA elemanlarının çoğalmasını, korunmasını ve yayılmasını araştırırız, bu da bunların dizilerinin belirlenmesini gerektirir. Bu protokol, uzun okuma dizilemesiyle ilgili kapsam ve doğruluk sorunlarına, plazmit DNA'yı zenginleştirerek ve montaj yöntemlerini optimize ederek değinir. Protokolümüzü, kromozomal dizinin bilinmesi veya alakasız olduğu durumlarda plazmitleri dizilemek için tasarladık.
Başlamak için, numuneleri uygun antibiyotik ile takviye edilmiş LB auger plakalarına çizme yapın, ilgili plazmit taşıyan direnç markörünü seçmek için. Plakalar 24 saat boyunca 37 derece Celsius'ta inkübe edin. Ertesi gün, uygun antibiyotik ile takviye edilmiş üç ila beş mililitre LB ortamına tek yalıtılmış koloni ile aşılayın.
Kültürü 37 derece Celsius'ta yaklaşık sekiz saat veya optik yoğunluk 600 nanometrede bir ila iki olana kadar sallamak üzere inkübe edin. Ardından, 400 mikrolitre başlatıcı kültüre 400 mililitre uygun antibiyotik ile takviye edilmiş LB ortamını aşılayın ve daha önce gösterildiği gibi inkübe edin. Ardından kültürü kültür hacmine uygun santrifüj şişelerine aktarın.
4.200 G'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve peleti üretici tarafından önerilen reaktif hacimlerini kullanarak yeniden askıya alın. Hücre lizisi ve nötralize edilmesinden sonra, lizatı 4.200 G'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve tekrar santrifüj yapın.
Eşdeğerleştirme, yıkama ve DNA elüsyonunu üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin. Ardından, nanopore kütüphanesi hazırlığı için konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak amacıyla çökeltilmiş DNA'yı 100 mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın. Sonrasında DNA'yı kantitatif olarak belirlemek için sunulan tabloya göre analiz tüplerini hazırlayın.
Florometreyi kalibre ettikten sonra, numune tüplerini fluorometreye yerleştirin ve cihaz el kitabına göre okumaları kaydedin. Termal çevrimi 30 derece Celsius'ta iki dakika ve ardından 80 derece Celsius'ta iki dakika olacak şekilde programlayın. Eritilmiş kit bileşenlerini sunulan tabloya göre çevirin ve karıştırın.
Termal çevrimi kullanarak barkodlama için hazırlanan PCR tüplerini inkübe edin. Ardından tüpleri buz üzerine soğumaya bırakın. Barkodlu numuneleri temiz bir 1,5 mililitrelik Eppendorf tüpünde birleştirin, toplam hacmin 1.000 mikrolitreyi geçmediğinden emin olun.
Boncukları çalkaladıktan sonra, birleştirilmiş barkodlu numunelere eşit hacimde boncuk ekleyin. Tüpü çalkalayın ve karıştırın, ardından 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından boncukları mıknatıs üzerindeyken bir mililitre 80% etanol ile yıkayın.
Etanolü çıkarın ve tekrarlayın. Tüpü mıknatıstan çıkarın. Boncukları, kullanılan barkod sayısına göre uygun hacimde elüsyon tamponunda yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
Başarılı kütüphane hazırlığını doğrulamak için nükleaz içermeyen suda elüsyon yapılan numunenin bir mikrolitresini kullanarak DNA konsantrasyonunu fluorometre ile kantitatif olarak belirleyin. Adaptör bağlanması için DNA kütüphanesinin 11 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın ve etiketleyin. Ardından, sunulan bileşenleri taze bir tüpte karıştırarak eritilmiş hızlı adaptörü seyreltin.
Daha sonra, DNA kütüphanesinin 11 mikrolitresine bir mikrolitre seyreltilmiş hızlı adaptör ekleyin ve içeriği karıştırmak için tüpü çalkalayın. Tüpü kısa süreli santrifüjleme yaparak içeriğin tamamını alt tabakaya toplamasını sağlayın ve tüpü beş dakika boyunca tezgah üzerinde inkübe edin. Yeni bir DNA tüpünde akış hücresinin ön hazırlık karışımını hazırlayın ve ters çevirerek ve pipetleme yaparak karıştırın.
Cihazın kapağını kaldırın ve akış hücresini içine yerleştirin, uygun yerleşimi sağlamak için hafif bir baskı uygulayın. Ön hazırlık bağlantı noktası içinde veya bitişiğinde hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol ettikten sonra, kabarcıkları gidermek için 20 ila 30 mikrolitre sıvıyı geri çekin. Ardından, ön hazırlık karışımının 800 mikrolitresini çekin ve kabarcıkları önleyerek ön hazırlık bağlantı noktasına boşaltın ve cihazı beş dakika boyunca oturtun.
DNA kütüphanesini uygun hacimdeki kütüphane boncukları ile yeni bir tüpte sunulan şekilde karıştırın. Akış hücresinin ön hazırlık bağlantı noktasına 200 mikrolitre ön hazırlık karışımı yükleyin. Örnekleme bağlantı noktası kapağını ayarlayın, böylece bağlantı noktası görünür hale gelir.
Örnekleme bağlantı noktasına, her damlanın önce emilinebilmesi için birer birer, boncuklu DNA kütüphanesinin 75 mikrolitresini dökün. Ardından örnekleme bağlantı noktası kapağını yeniden uygulayın ve ön hazırlık bağlantı noktasını kapatın. Cihaz kapağı kapatıldıktan sonra, dizileme çalışmasını başlatın.
Ç
Overview
This article presents a detailed workflow for nanopore sequencing aimed at maximizing plasmid DNA yield and sequencing accuracy. The protocol encompasses plasmid extraction, rapid barcoding, adapter ligation, sequencing, and sequence assembly, and is suitable for a wide range of plasmid sizes and levels of chromosomal contamination. The method is demonstrated using Escherichia coli as a model organism.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- Genomics
- Microbiology
Background
- Plasmid sequencing is essential for genetic studies, recombinant gene expression, and plasmid capture experiments.
- Traditional sequencing methods may be limited by chromosomal contamination and low plasmid yield.
- Nanopore sequencing offers long-read capabilities and real-time data acquisition.
- Efficient workflows are needed to optimize plasmid sequencing throughput and accuracy.
Purpose of Study
- To develop and describe a robust workflow for nanopore-based plasmid sequencing.
- To maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy.
- To enable efficient parallel sequencing of multiple samples.
Methods Used
- Plasmid DNA extraction from clinical E. coli strains.
- Library preparation using rapid barcoding and adapter ligation.
- Loading libraries onto a nanopore flow cell for sequencing.
- Base calling performed in real time or post-hoc.
- Sequence assembly using Autocycler.
- Comparison of assemblies to gel mobility and short-read polished assemblies.
Main Results
- Plasmid assemblies matched sizes inferred from gel mobility.
- In two-thirds of cases, assemblies matched or closely resembled short-read polished assemblies (within 0.05% pairwise identity).
- Protocol supports plasmids from 4 to 174 kb in size.
- Up to 72% chromosomal contamination tolerated without loss of accuracy.
- Parallel sequencing of up to 24 samples achieved with optimal coverage.
Conclusions
- The workflow enables accurate and efficient plasmid sequencing using nanopore technology.
- It is suitable for plasmid verification, improving WGS-derived plasmid sequences, and sequencing plasmids captured by conjugation.
- The protocol is robust to chromosomal contamination and applicable to a range of plasmid sizes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Long-read nanopore plasmid sequencing enables high-confidence verification and assembly of plasmid constructs, supporting critical quality control and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This workflow addresses the challenge of chromosomal contamination and variable plasmid yield, providing robust, scalable solutions for recombinant DNA and gene therapy vector development. Its parallelization and tolerance for mixed DNA inputs streamline early discovery and preclinical workflows, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of engineered plasmids for functional studies and target validation.
- Reduces ambiguity in construct identity, supporting mechanistic de-risking in discovery biology.
- Facilitates rapid triage of candidate constructs for downstream screening or expression.
Screening & Assay Development
- Provides validated sequence data for assay-ready plasmids, ensuring reproducibility in screening campaigns.
- Supports parallel sequencing of up to 24 samples, increasing throughput for construct libraries.
- Delivers quantitative sequence accuracy, enabling reliable comparison across engineered variants.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical studies by confirming plasmid integrity in disease-relevant systems.
- Enables sequence verification for plasmids used in gene delivery or biomarker studies.
- Supports risk-adjusted advancement by minimizing sequence-related uncertainties in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based workflow integrates from early construct verification through screening and preclinical validation, supporting both hypothesis-driven and translational research pipelines.
- Discovery Biology: Confirms plasmid sequence fidelity, reducing risk of off-target effects in functional assays.
- Screening: Ensures assay-ready constructs are sequence-verified, supporting reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides high-accuracy, quantitative sequence data for cross-sample comparison and quality control.
- Translational Research: Aligns plasmid sequence verification with preclinical model requirements for gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, parallelizable sequencing capability adaptable across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct-driven studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes plasmid verification, tolerates high chromosomal contamination, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring construct integrity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmid extraction, library preparation, and nanopore sequencing workflows.
- Demands computational infrastructure scaled to real-time or post-hoc basecalling needs.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of plasmid sizes and host backgrounds, including high chromosomal DNA content.
- Best suited for applications where chromosomal sequence is known or not required.
