Nanopore dizileme tabanlı iş akışları kullanarak uzun okuma plazmid dizileme ve montajı

Kendi kendine çoğalan dairesel DNA elementlerinin, plazmidler olarak bilinen, çoğaltılması, bakımı ve yayılmasını araştırıyoruz; bu da dizilerinin belirlenmesini gerektiriyor. Bu protokol, uzun okuma dizileme ile ilgili kapsama ve doğruluk sorunlarını plazmid DNA'sını zenginleştirerek ve montaj yöntemlerini optimize ederek ele alır. Protokolümüz, kromozom dizisinin bilindiği veya önemsiz olduğu durumlarda plazmidleri dizelemek için tasarlanmıştır.

Başlamak için, örnekleri uygun antibiyotikle takviye edilmiş LB burgu plakalarına çizerek ilgili plazmid taşınan direnç belirtecini seçin. Plakaları 37 derece Celsius'ta 24 saat boyunca kuluçka edin. Ertesi gün, uygun antibiyotikle desteklenen üç ila beş mililitre LB ortamını tek bir izole koloni ile aşılayın.

Kültürü yaklaşık sekiz saat boyunca 37 derece Celsius'ta sallayarak veya 600 nanometrede optik yoğunluk bir ila iki seviyeye ulaşana kadar kuluçka yapın. Daha sonra 400 mililitre LB ortamını uygun antibiyotikle takviye ederek 400 mikrolitre başlangıç kültürü ile aşılayın ve daha önce gösterildiği gibi kuluçka yapın. Sonra kültürü, kültür hacmine uygun santrifüj şişelerine aktarın.

4, 200 G'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve üreticinin önerdiği reaktif hacimleriyle peleti tekrar askıya alın. Hücre lizin ve nötralizasyondan sonra, lizat 4.200 G ile 30 dakika boyunca santrifüj edilir. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve tekrar santrifüj yapın.

Üreticinin talimatlarına göre dengeleme, yıkama ve DNA elütasyonu yapılmalıdır. Daha sonra çökeltilmiş DNA'yı 100 mikrolitre nukleazsız suya yeniden süsleyerek nanopore kütüphanesi hazırlığı için konsantrasyonu maksimize eder. Sonrasında, DNA'yı niceliklendirmek için, analiz tüplerini sunulan tabloya göre hazırlayın.

Florometre kalibrasyonundan sonra, örnek tüplerini florometreye yerleştirin ve ölçümleri cihaz kılavuzuna göre kaydedin. Termal döngüleyiciyi iki dakika boyunca 30 derece Celsius'a, ardından iki dakika boyunca 80 derece Celsius ile programlayın. Eritilmiş kit bileşenlerini sunulan tabloya göre döndürüp karıştırın.

Barkodlama için hazırlanmış PCR tüplerini termal döngücü programı kullanarak kuluçka edin. Sonra tüpleri soğuması için buzun üzerine koyun. Barkodlu örnekleri temiz bir 1,5 mililitrelik Eppendorf tüpünde bir havuza alın, böylece toplam hacim 1.000 mikrolitreyi aşmamalıdır.

Boncuklar girdablandırıldıktan sonra, havuzlanmış barkodlu örneklere eşit miktarda boncuk ekleyin. Tüpü çevirerek karıştırın, ardından 10 dakikalık kuluçka yapın. Sonra boncukları mıknatıs üzerinde bir mililitre %80 etanol ile yıkayın.

Etanolü çıkarın ve bir kez tekrarlayın. Tüpü mıknatıstan çıkarın. Boncukları kullanılan barkod sayısına göre uygun hacim kullanılarak elusyon tamponunda yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.

Başarılı kütüphane hazırlığını doğrulamak için florometrede kaçırılan bir mikrolitre numuneyi kullanarak DNA konsantrasyonunu nicelikle ölçebilirsiniz. Adaptör ligasyonu için, DNA kütüphanesinden 11 mikrolitre yeni bir tüpe aktarın ve etiketleyin. Sonra sunulan bileşenleri taze bir tüple karıştırarak erimiş hızlı adaptörü seyreltirin.

Sonra, 11 mikrolitre DNA kütüphanesine bir mikrolitre seyreltilmiş hızlı adaptör ekleyin ve içeriği karıştırmak için tüpü çevirin. Tüpü kısa bir süre aşağı döndürerek tam hacmin alt kısımda toplanmasını sağlayacak şekilde tüpü beş dakika boyunca tezgahta inkubasyon yapın. Akış hücresi priming karışımını taze bir DNA tüpünde hazırlayın ve ters çevirme ile pipetleme ile karıştırın.

Cihazın kapağını kaldırın ve akış hücresini içine yerleştirin, doğru yerleştirmeyi sağlamak için hafif bir baskı uygulayın. Astar portunun içinde veya yanında hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol ettikten sonra, kabarcıkları çıkarmak için 20 ila 30 mikrolitre sıvı geri çekin. Sonra 800 mikrolitre priming karışımı çekip hava kabarcıklarından kaçınarak astarlama portuna dağıtın ve cihazı beş dakika bekletin.

Burada sunulduğu gibi uygun miktarda kütüphane boncukları ile yeni bir tüpte DNA kütüphanesini karıştırın. Akış hücresi priming portuna 200 mikrolitre priming karışımı yükleyin. Numune portu kapağını portu gösterecek şekilde ayarlayın.

DNA kütüphanesinden 75 mikrolitreyi boncuklarla birlikte örnek portuna birer damla dağıtın, böylece her damla bir damlayı ekleyip sonra emsin. Sonra örnek port kapağını tekrar uygulayın ve astar portunu kapatın. Cihaz kapağı kapandıktan sonra dizileme çalışmasına başlayın.

Çalışma süresi sınırını, çoklanan plazmid sayısına göre belirleyin; varsayılan olarak 48 saat ve maksimum 72 saat olsun. Süper doğru temel çağrı modunu ve uygun hızlı barkod kiti seçeneğini seçin. Sonra ham FAST5 veya POD5 verilerini seçip temel aramaya başlayın.

Aşağı akış montajı için filtrelenmiş bir FASTQ dosyası oluşturmak için, Filtlong ile uzun okumaları kısaltarak en düşük kaliteli okumaların yaklaşık %5-10'unu kaldırır ve toplam verimin yaklaşık %90'ını korur. Alt örneklem, önerilen ayarlara göre Autocycler kullanılarak okunur. Her okuma alt kümesini Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler ve diğer seçilmiş assemblerler kullanarak birleştirin.

Her montaj grafiği dosyasını bandaj kullanarak görselleştirin. Çevreleri dairesellik, montaj cihazları arasında boyut tutarlılığı ve kimerik eklemlerin kanıtları açısından değerlendirin. Birden fazla montajcı arasında destek eksikliği olan doğrusal contigleri kaldırın ve tutarlı boyut tahminleriyle dairesel bağlantıları koruyun.

Büyük plazmidler dairesel hale getirildiğinde konsensus oluşturulmadan önce küçük desteklenmeyen contigleri kaldırın. Manuel küratörlükten sonra konuzsu oluşturmaya geçin. Özenle oluşturulmuş montajlarla Autocycler kullanarak konsensus dizimini oluşturun.

Kalan Autocycler komutlarını çalıştırarak nihai konsensus plazmid dizisini üretin. Son olarak, nihai montajı Medaka ile kesilen uzun okumalarla parlatarak uzlaşma doğruluğunu artırın. Tüm konjugasyon testleri transkonjugantlar üretti ve donörlerde konjugatif plazmid varlığını doğruladı.

Birleştirilmiş plazmid dizilerinin boyutları, darbe alanı jel elektroforez hareketliliğine dayalı tahminlerle uyumluydu. Nanopore dizileme, analiz edilen tüm örnekler için yeterli okuma çıktısı ve kalitesi sağladı. Kromozom kontaminasyon oranları %72,1 ile %28,0 arasında değişiyordu ve ortalama %46,9 idi. Suş plazmidinin darbe alanı jel elektroforezi analizi, yaklaşık 145 kilobaz çiftinden oluşan bir plazmide karşılık gelen bir bant UPEC_271 ortaya koydu.

Transkonjugantlardan birinden alınan DNA, 145 kilobaz ile aynı bir dizi gösterdi. Suş kanının darbe alanı jel elektroforezi analizinde yaklaşık 70 ve 110 kilobaz çiftinden oluşan iki plazmid 100913 tespit edilmiştir. Nanopore dizileme, 71.182 baz çifti ve 111.226 baz çiftinden oluşan iki plazmid montajını doğruladı.

En önemli husus, kromozom dizisinin ilgi çekici olup olmadığıdır. Eğer öyleyse, standart tüm genom dizileme protokolleri daha iyidir. Protokolümüzün artan kapsamı, heteroplazminin çalışmasına kapı açıyor, yani,

Belirli bir popülasyon içinde plazmid dizisi varyasyonu.