E. coli ve memeli hücrelerinde genetik kod genişletmesiyle siteye özgü lizin laktilasyonu

Taklit ve enzim sınırlamalarını aşmak için bir saat/RS tRNA sistemi geliştirdik; böylece biyolojik olarak hassas lizin laktilasyonu dahil edilmesini mümkün kılmıştır. Bu protokol, tümör metabolizması, enzim fonksiyonları ve saat bölgelerini incelemek için uygulanabilir. Başlangıç olarak, yaklaşık 100 nanogram istenen plazmidle kimyasal olarak yetkin Escherichia coli DH10B hücrelerini birlikte dönüştürün. Dönüşüm karışımını buzda 25 dakika kuluçka edin, ardından 42 derece Celsius'ta 45 saniye sıcak şokla geçirin.

Tüpü üç dakika buz haline getirin. 350 mikrolitre Luria bertani ortamı ekleyin ve tüpü dakikada 220 devirde 37 derece Celsius'ta bir saat boyunca sertçe sallayın. Şimdi dönüştürülmüş hücre kültürü, ampisilin ve kloramfenikol ile takviye edilmiş Luria bertani agar plakasına yayılır.

Plakayı 37 derece Celsius'ta 12 ila 16 saat kuluçka yapın. Sonra tabaktan tek bir koloni seçerek dört mililitrelik bir başlangıç kültürünü aşılayın ve gece boyunca kuluçkaya geçirin. Ertesi gün, gece kültürünü ampisilin ve kloramfenikol içeren 400 mililitre Luria bertani ortamına genişletin.

Kültürü dakikada 220 devir ve 37 derece Celsius sıcaklığında şiddetle sallayın, 600 nanometrede optik yoğunluk 0,6 ile 0,8 arasında ulaşana kadar. Sonrasında kültürü %0,2 L-Arabinoz ve bir milimolar laktil lizin ile indüke edip, 30 derece Celsius ve dakikada 220 devir aralıkta 16 saat boyunca kuluçka yapın. Tohum hücreleri, bir mililitre DMEM kullanarak 12 kuyu başına beş hücre gücünde 12 kuyuyla bir hücre yoğunluğunda bir kat 10 bir plaka üretir.

Hücre birleşimi %70 ile 80 arasında olana kadar 24 saat kuluçka yapın, ardından transfeksiyona geçin. Sulandırılmış DNA çözeltisini hazırlamak için, yüksek glikozlu serumsuz DMEM'e bire bir oranda 0,75 mikrogram plazmid ekleyin. Karıştırmak için hafifçe yukarı aşağı veya girdabla kıpırda.

Sulandırılmış transfeksiyon reaktifini hazırlamak için, yüksek glikozlu serumsuz DMEM'e 2,25 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Yavaşça pipet yapın ve iyice karıştırmak için üç-dört kez yukarı ve aşağı indirin. Hemen seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini seyreltilmiş DNA çözeltisine bir anda ekleyin.

Şimdi üç-dört kez yukarı ve aşağı pipetleyin, içeriği karıştırın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçka altına geçirin, böylece transfeksiyon ve DNA kompleksleri oluşsun. Her kuyunun içine 50 mikrolitre transfeksiyon ve DNA kompleksi damla olarak ekleyin ve karışımı homojenleştirmek için plakayı nazikçe döndürün. Transfeksiyondan altı saat sonra, ortamı bir milimolar laktil lizin içeren taze DMEM ile değiştirin ve hücreleri 24 ila 48 saat boyunca kültürleyin.

Escherichia coli'de, büyüme ortamına bir milimolar laktil lizin eklendiğinde tam boy hENO1-89Klac üretilmiştir. İmmünoblottasyon, anti-His etiketi ve anti-L-laktil lizin antikorları kullanılarak tam boy hENO1-89Klac varlığını doğruladı. Uçuş kütle spektrometrisinin elektrosprey iyonizasyon süresi, 48.178 Dalton olarak baskın bir zirve gösterdi; bu, başlatıcı metyonin içermeyen hENO1-89Klac'ın beklenen kütlesiyle eşleşti.

Triptych sözümünün tandem kütle spektrometrisi, modifiye peptide tam bir B&Y ion serisi eşlemesi yoluyla Klac'ın Residue 89'da yer özelliğine entegre edildiğini doğruladı. Memeli HEK293T hücrelerinde, floresan mikroskopisinde Klac 24 ve 48 saat eklendiğinde hücreler genelinde güçlü sfGFP ekspresyonu görülürken, Klac takviyesi olmadan floresans gözlemlenmemiştir. Akış sitometrisi, hücrelerin yaklaşık %31'inin 24 saat sonra sfGFP ifade ettiğini, 48 saatlik Klac takviyesi sonra yaklaşık %37'ye yükseldiğini gösterdi.

Bu protokol, protein fonksiyonu üzerindeki siteye özgü lizin laktilasyonu etkilerinin araştırılmasını sağlar ve ortaya çıkan biyolojik ve fonksiyonel sonuçların ölçülmesini kolaylaştırır. Bu prosedürün ardından araştırmacılar mekanik çalışmalar yapabilir, yüksek verimli tarama testleri yapabilir ve genişletilmiş fonksiyonel analiz için stabil hücre hatları oluşturabilirler. Gelecekteki çalışmalarımız verimliliği artırmayı, kararlı entegrasyonu mümkün kılmayı ve saat biyosentezini geliştirmeyi hedeflemektedir.