Baş ve Beyinden Lenfatik Taşınmayı Değerlendirmek İçin Boyun Lenf Kanalı Kanülasyonlu Fare Modeli

Projemiz, beyin lenfatiklerinin Alzheimer, felç ve nöroinflamasyon gibi MSS hastalıklarıyla nasıl ilişkili olduğunu inceleyerek beyinden boşalan maddeleri tespit ediyor. Mevcut yöntemler, bu protokol sayesinde mümkün olan CNS'ten türetilen lenfatik çıkışı teorik olarak örneklemek ve nicelendirmek için protokol ve güvenilir bir yaklaşımdan yoksundur. Başlangıç için, polietilen kanülün iç yüzeyini kaplamak için 30 kalibre iğne ile yaklaşık 0,7 mililitre seyreltilmiş antikoagülant çözeltisi bir mililitrelik steril insülin şırıngasına önceden yüklenin.

Önceden yüklenmiş şırıngayı steril koşullarda kullanana kadar sakla. Kanülleri hazırlamak için, her iki terminal kesim için 0,5 milimetre dış çaplı ve 0,3 milimetre iç çaplı borular, orta bölüm için ise 0,6 milimetre dış çaplı ve 0,5 milimetre iç çaplı borular kullanın. Makasla, kanül segmentlerini şırınga iğnesine bağlanan proksimal kısım için iki santimetre, orta bölüm için 40 santimetre ve kanülasyon için tasarlanmış distal kısım için sekiz santimetre uzunlukta kesin.

Kanülü baştan kuyruğuna bir şekilde monte edin. Daha sonra kanül montajının distal ucunu yaklaşık 45 derece açıyla kesip eğimlenerek servikal lenf kanalına düzgün yerleştirmeyi kolaylaştırın. Her kanülün açıklığını, önceden yüklenen şırıngayı monte edilmiş kanülün proksimal ucuna bağlayarak doğrulayın.

Kanülü yıkamak için nazikçe küçük bir hacim çözelti bırakın. Çözeltinin distal uçtan sızıntı belirtisi olmadan sorunsuz çıkışını sağla. Anestezi edilmiş bir fareyi 37 derece Celsius sıcaklığında tutulan ısıtmalı cerrahi pedin üzerine sırtüstü konumlandırın.

Gerekirse başı eğip boynu küçük bir destek yastığı kullanarak uzatarak servikal bölgenin açığını artırın. Ön uzuvları hareketi en aza indirmek için lastik bantlar veya cerrahi bantlarla nazikçe tutun. Tıraş olunması kolaylaştırmak için servikal bölgedeki tüyleri steril normal salinle durulayın.

Daha sonra kesiden önce tüylerin tamamen alınmasını sağlamak için tüm cerrahi bölgeyi iyice tıraş edin. İlk kesinin uzunluğunu doğrulamak için cerrahi bölgeyi 2,5 santimetre noktalı bir çizgi çizerek işaretleyin. Kesinin üst ucunu alt dudağın yaklaşık 1 ila 1,5 santimetre altına yerleştirin.

Anestezik derinliği parmak sıkıştırma refleksiyle doğrulandıktan sonra, servikal kasların yüzeysel tabakasını işaretli çizgi boyunca dikkatlice kesin. Daha sonra kalan kas katmanlarını, özellikle yüzeysel servikal fasya, nazikçe ayırarak servikal arterin ortaya çıkmasını sağlar. Sternomastoid kası ve submandibular bezi geri çekin ve servikal lenf kanalının tanımlanmasını kolaylaştırmak için cerrahi alandan uzaklaştırın.

Cerrahi pencereyi korumak için bir doku genişletici kullanın. Pamuk çubukla, lenf düğümü ve ilgili lenf kanalını tespit ederken kas dokusunu geçici olarak kenara bırakın. Karotis arterine paralel uzanan opak renksiz servikal lenf kanalını bulun.

Kör forseps kullanarak, ayrılmış bağ dokularından nazikçe geçin ve forsepsleri yerinde tutun. Köşe limf kanalını, çevredeki bağ ve yağ dokularından künt diseksiyon ile dikkatlice izole edin. Sonra açıkta kalan damarın üst yarısında küçük bir kesi oluşturun.

Cerrahi pencereden yaklaşık 1,5 santimetre uzaklıkta, kanül için ek bir fiksasyon noktası olarak küçük bir ikincil deri delintisi oluşturulabilir. Kanülü ikinci açıklıktan geçirin, pensasla distal ucunu tutun ve eğimli yüzünün yukarıya doğru yönlendirildiğinden emin olun. Sonra, distal ucu kesi üzerinden yaklaşık iki milimetre nazikçe lenf kanalına yerleştirin ve başa doğru yönlendirin.

Kanülün proksimal ucunu bir ila iki dakika boyunca izleyin. Başarılı kanülasyonu yavaş ve düzenli bir lenf sıvısı akışı gözlemleyerek doğrulayın. Kanülü, kesi yerine ve ikincil fiksasyon deliğine pipet ile küçük bir damla siyanoakrilat doku yapıştırıcısı uygulayarak sabitleyin.

Düzenli çıkışı doğrulamak için lenf akışını birkaç dakika boyunca gözlemleyin. Sonra doku genişleticisini dikkatlice çıkarın ve alt mandibular bezi orijinal yerine yerleştirin. Kanülün distal ucuna önceden etiketlenmiş, antikoagülan kaplı bir mikrosantrifüj tüpü takın.

Sonra tüm kas katmanlarını orijinal yerlerine yerleştirin ve cilt kesisini dikiş ve/veya doku yapıştırıcısı ile kapatın. Lenf, antikoagülan kaplı mikrosantrifüj tüplerine sürekli olarak toplayın, tüpleri önceden belirlenmiş aralıklarla, genellikle saatte bir değiştirin. Farenin toplama süresi boyunca anestezi altında kalmasını sağlayın.

Toplanan örnekleri buz paketleriyle soğutucu kutuda sakla. Başarılı şekilde kanüllenmiş sıçanlarda altı saatlik toplama süresi boyunca ölçülen saatlik lenf akış hızları saatte 0,09 ila 0,13 mililitre arasında değişiyordu. Sağlıklı farelerde, intrastriatal uygulanan, trityum etiketli albümin birikimli lenfatik taşınımı ilk iki saat boyunca önemsiz kaldı ve sonrasında önemli ölçüde arttı.

Lenf ve plazma arasında trityum etiketli albümin konsantrasyonlarının karşılaştırılması, sağlıklı sıçanlarda zaman içinde farklı konsantrasyon profillerini göstermiştir. Escherichia coli lipopolisakkaridinin interperitoneal uygulanmasıyla indüklenen nöroinflamasyon, sekiz saat boyunca toplam lenf akış hızının hafifçe azalması ve lenfa taşınan toplam dozun oranında neredeyse iki kat azalma ile ilişkilendirildi. Lenf-plazma konsantrasyon oranı, sağlıklı ve nöroiniltihaplı sıçanlar arasında anlamlı bir fark göstermedi; bu da benzer servikal lenfatik klirens profillerini gösterdi.

Bu protokol, beyin kaynaklı lenfin doğrudan biyolojik örneklemesini mümkün kılarak dolaylı dış görüntüleme veya reçineli yöntemi ölçülebilir merkezi sinir sistemi çıkışıyla birleştirdi. Protokol, lenfatik yollar üzerinden merkezi olarak uygulanan ilaç temizlenmesinin incelenmesini sağlar; böylece drenaj yolları ve temizlik oranları ölçülür. Gelecekteki çalışmalar, MSS hastalık durumlarının lenfatik klirense nasıl uyarı verdiğini inceleyebilir ve bu bilgiyi tedavi için beyin lenfatik fonksiyonunu yeniden kazandırmak için ilaçları optimize etmek için kullanabilir.