Bebek Bağışıklığını Minimum Girdiyle Haritalama: Bütünleşik Tek Hücreli ve Multiomik Profilleme

Araştırmamız, küçük kan hacimlerinden boylamasına yüksek boyutlu multiomik profilleme kullanarak erken yaşam bağışıklığının doğumdan sonra nasıl adapte olduğunu tanımlıyor. Bu protokol, sağlık, enfeksiyon ve iltihap genelinde sınırlı biyoörneklerden uzunlamasına bağışıklık profili için neonatal ve pediatrik çalışmalara uygulanabilir. Başlamak için, lizlenmiş bebek kırmızı kan hücreleri içeren bir şişeni 37 derece Celsius su banyosunda hızla eritin.

Çözülen hücreleri, 37 derece Celsius'ta 10 mililitre sıcak tam RPMI ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 g'de santrifüjle yapın ve süpernatantı atın. Hücre pelletini üç mililitre tam RPMI ortamında tekrar askıya alın ve toplam hücre sayısını sayın.

Konsantrasyon saymak için çok yüksekse örneği seyrelt. Hücreler sayıldıktan sonra, santrifüj adımını tekrarlayın ve hücreleri tam RPMI ortamında yeniden askıya alın, böylece mililitrede bir milyon hücre konsantrasyonu elde edilir. 96 kuyruklu V-taban plakasının her kuyusuna 0,1 milyon hücre içeren 100 mikrolitre aktarın.

Plakayı 764 g sıcaklıkta, dört derece Celsius'ta iki dakika boyunca santrifüjlendirin. Üst yüzeyi at. Sonra, 100 mikrolitre canlı ölü boya stokundan 100 mikrolitre, FC bloğu ile 2.000 PBS ile seyreltilmiş 2.000 PBS ile 100 mikrolitre, lekelenmemiş kontrol hariç tüm örneklere 100 ile 100 ile ekleyin.

Örnekleri dört derece Celsius'ta 15 dakika kuluçka altına alın. Hücreleri yıkamak için 100 mikrolitre PBS ekleyin. Plakayı 764 g sıcaklığında dört derece Celsius'ta iki dakika boyunca santrifüjle edin ve süpernatantı dikkatlice atın.

Lekelenmemiş kontrol hariç tüm örneklere 100 mikrolitre yüzey antikor kokteyli, floresansla aktive hücre ayırma veya FACS tamponu ile 200'e seyreltilmiş, bir mikrolitre eklenin. Dört derece Celsius'ta 30 dakika kuluçka yapın. Sonra hücreleri 100 mikrolitre FACS tamponu ile yıkayıp santrifüj yapın ve süpernatantı atın.

Her numuneye 100 mikrolitre %4 paraformaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka yapın, sonra hücreleri tekrar yıkayın ve 200 mikrolitre FACS tamponunda tekrar süzülün. UltraComp telafi boncuklarını tek renkli kontroller olarak hazırlayın.

Tek renkli kontrol boncuklarını, örneklerle aynı prosedürle boyanın; örnekler sabitlenmişse fiksasyon dahil. Ayrıca, floresansı bir veya FMO kontrolü olmadan aynı şekilde hazırlayın. Örnekleri, tek renkli kontrolleri, lekesiz kontrolleri ve floresan-eksi bir kontrolleri geleneksel veya spektral akış sitometresinde çalıştırın.

FlowJo'yu açın ve ilgilendiğiniz örneği analiz etmek için seçin. Uygun izotip ve FMO kontrolleri kullanarak kapıları ayarlayın. FSC ile SSC arasındaki kapı lökositleri kullanarak enkaz hariç ve hücreleri boyut ve granülarlığa göre seçin.

FSCA ile FSCH arasındaki çiftlikleri hariç tutun. Ölü hücreleri dışlamak için canlı hücreleri canlılık boyası kullanarak kapı aç. Canlı tek hücrelerden CD33-negatif lenfositler ve CD-33-pozitif miyeloid hücrelere bölünür.

CD33-pozitif hücrelerde CD14-pozitif monositler tanımlanır. Daha sonra CD33-pozitif hücreler içinde CD14-negatif, CD11C-pozitif dendritik hücreler tanımlanır. Şimdi, CD33 negatif lenfositler arasında yürüyüş CD3-pozitif T hücreleri ve CD3 negatif CD56 pozitif doğal katil hücreler bulunmaktadır.

CD3-pozitif T hücrelerinde CD8-pozitif ve CD4-pozitif alt kümeleri tanımlanır ve CD3-negatif, CD56-negatif, CD19-pozitif B hücreleri tespit edilir. Başlamak için, kriyo-muhafaza edilmiş kırmızı kan hücresi lizizlenmiş hücrelerden oluşan bir şişe, 37 derece Celsius su banyosunda eritin. Süspansiyon, 10 mililitre T-hücreli ortam içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe ve 430 g ağırlığında beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın.

Üst yüzeyi at. Hücre pelletini bir mililitre PBS ile yeniden askıya alındıktan sonra, numuneye dokuz mililitre daha PBS ekleyin. Tüpü 430 g'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın ve süpernatantı atın.

Hücreleri sayın ve trypan blue hariç kullanılarak canlılığı değerlendirin. Eğer yaşamlılık %70'in altındaysa, aşağıdaki gibi ölü hücre temizleme kiti kullanmaya devam edin. İlk olarak, steril çift damıtılmış suyla 20x bağlama tampon stok çözeltisi seyreltilerek 1x bağlama tamponu hazırlanır.

Hücre peletini her 10 mikrolitre ölü hücre çıkarma mikroboncuklarına yeniden askıya alın, toplam yedi hücrenin gücüne kadar. İyi karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın. Manyetik ayırma kolonunu uygun manyetik standa ve bir toplama borusuna yerleştirin.

Sonra kolonu 500 mikrolitre 1x bağlayıcı tampon ile durulayarak dengeleyin. Hücre askı hacmini 1x bağlama tamponu ile 500 mikrolitre indirin. Toplama borusunu değiştirdikten sonra, hücre süspansiyonunu kolona uygular ve akışı yeni 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde toplar.

Sonra, kolonu 500 mikrolitre bağlama tamponu ile iki kez yıkayın ve akışı aynı mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Eluatı 300 gramda 10 dakika boyunca santrifüjle yapın ve üst yüzeyi atın. Hücreleri sayın ve tekrar Trypan Blue hariç tutularak canlılığı değerlendirin.

Aliquot 20.000 canlı hücreyi yeni bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Sonra hücreleri 300 g ile 10 dakika boyunca santrifüjle yapın ve süpernatantı çıkarın. Hücreleri %0,04 BSA içeren 40 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.

Son olarak, hücreleri içeren tüpü buz üzerine yerleştirin ve hemen kütüphane üretimi ve dizileme için genomik çekirdek tesisine gönderin. Hücre korucusu çıktıları formatında dizinleme sonuçlarını toplayın. Erken doğuştan ve kontrol kontrollerinden alınan kurutulmuş kan lekesi örnekleri işlendi.

Ve 92 bağışıklık ilişkili proteinin normalleştirilmiş protein ekspresyonu nicelendirildi. Lenfosit-aktivasyon geni üç ve sinyal eşiğini düzenleyen transmembran adaptörü 1'in ekspresyonesi, iki aylık erken bebeklerden periferik kanda termal kordon kanına kıyasla anlamlı olarak daha yüksekti. Kırmızı kan hücresi lizlenmiş beyaz kan hücresi örneklerinden lökosit popülasyonlarını belirlemek için kapsamlı bir kapı stratejisi kullanıldı.

T hücresi popülasyonu içinde CD4-pozitif ve CD8-pozitif alt kümeler ayırt edildi. Filtreleme işleminden sonra, tek hücreli ribonüklein asit dizileme veri setinde 120.000'den fazla hücre yakalanıp profillendi. Boyut küçültme ve kümeleme analizi 14 farklı hücre kümesi tespit etti.

Hücre kümeleri, farklı olarak ifade edilen genler ve bilinen hücre belirteçleri temelinde notanslandırıldı. 14 kümeden 12'si, T hücreleri, doğal katil hücreler, B hücreleri, miyeloid hücreler ve nötrofiller dahil olmak üzere bağışıklık hücre hatlarına karşılık geliyordu. Üst üste bir çubuk grafik, bir haftalık, bir ay ve iki aylık yaş boyunca küme başına hücre oranını göstermiştir.

Bu çalışma, sınırlı hacimli kan örneklerinden hücresel, transkriptomik, proteomik ve fonksiyonel bağışıklık imzalarının uzunlamasına ölçülmesini sağlar. Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemleri sağlıklı bağışıklık yörüngelerini tanımlamak ve hastalıklarla bağlantılı düzensiz erken yaşamda bağışıklık yanıtlarını ortaya çıkarmak için kullanabilir.