Nanodisklerde Membran Proteinlerini Stabilize Etme Tekniği

Bu protokol, oluşturulmuş bir yöntem çerçevesiyle tekrarlanabilir nanodisk yeniden yapılandırma iş akışını vurgular. Deterjanlar zar proteinlerini dengesizleştirir. MSP ve lipidli nanodiskler, kriyo-EM ve lizis için doğal yapıyı algılar.

Kloroformda hazırlanmış lipid bileşenlerini cam test tüpüne ekleyerek 100 mikrolitrelik bir lipid karışımı hazırlayın ve iyice karıştırın. Kloroformu hafif bir azot gazı akışı altında buharlaştırın, tüm sıvı tamamen uzaklaştırılana kadar. Cam test tüpüne yaklaşık iki mililitre n-pentan damla olarak ekleyin ve çözücüyü azot gazıyla buharlaştırarak kuru, şeffaf bir lipid filmi elde edin.

Tüpün kapağını gevşettikten sonra, tüpü vakum kurutucuya yerleştirin. Kurutucuyu boşaltın ve kalan çözücüleri çıkarmak için vakumda kalın. Daha sonra vakum kurutucudan lipid filmi çıkarır ve lipid filmi nemlendirilerek 250 mikrolitre deterjansız, düşük tuzlu tampon eklenir; böylece mililitrede 10 miligram nihai lipid konsantrasyonu elde edilir.

Lipid yeniden süzüldükten sonra, dört cam tüpe eşit şekilde bölün. Askıları berrak ve şeffaf hale getirerek başarılı lipozom oluşumunu gösteren sonikasyon yapın. Sonra hemen her tüpün baş boşluğunu azot gazıyla yıkayın ve kullanılana kadar -80 derece Celsius'ta saklayın.

E.coli BL21 hücrelerinin MSP1D1 plazmid ile dönüşümünden sonra, 7-histidin etiketi taşır ve ardından kültür genişletilmiştir. MSP ekspresyonunu IPTG'nin nihai konsantrasyonuna 0,5 ile bir milimolar arasında ekleyerek indükleyin. Sonra hücreleri 16 derece Celsius'ta 16 ila 20 saat boyunca sallayarak kültüre geçirmeye devam edin.

Bakteri kültürünü dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve hücre pelletini kalın. Daha sonra bir litre kültürden elde edilen pelleti 100 ila 150 mililitre lizis tamponu içinde yeniden askıya alın.

Görünür bir küme olmadan eşit bir süspansiyon elde edilene kadar iyice homojenize edin. Sonra, üç saniyelik darbeler ve ardından altı saniyelik duraklamalarla bakterileri %35 güçte kırmak için soğutmalı ultrasonik hücre bozucu kullanın. Lizat berrak ve açık kahverengi olana kadar sonikasyona devam edin.

Lizat 30.000g ile 45 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj edin ve sonraki adımlar için süpernatantı toplayın. Süpernatantı dengelenmiş nikel-NTA reçinesi ile inkübe edilip safsızlıkları gidermek için yıkamadan sonra, hedef proteini eluyon tamponu ile elüasyon yapın ve eluat fraksiyonlarını toplayın. Eluatın 280 nanometrede emilimi 0.01'in altına düşene kadar fraksiyonları toplamaya devam edin.

Sonra biriktirilen eluatı diyaliz tüplerine aktarın ve gece boyunca nazikçe karıştırarak dört derece Celsius'ta diyaliz tamponuna karşı diyaliz yapın. Diyalizden sonra, ultra-filtrasyon cihazı kullanarak çözeltiyi konsantre ederek mililitrede iki ila beş miligram nihai MSP konsantrasyonu elde edinin. Yaklaşık 250 miligram biyo-boncukları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne koyun.

Tüpe 25 ila 30 mililitre metanol ekleyin. Karanlıkta karışımı iyice döndürün veya vortex yapın. Tüpü dört derece Celsius'ta 20 dakika kuluçka yaptıktan sonra, süpernatantı dikkatlice atın ve metanol yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Benzer yıkamaları çift damıtılmış suyla üç kez yapın, ardından boncuklara 25 ila 30 mililitre deterjansız, düşük tuzlu tampon ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi, tüpü döner bir masada sallamak veya döndürmek için karıştırın ve kuluçka yapın. Üst yüzeyi atın ve boncukları tam olarak koşullandırmak için düşük tuzlu tampon dengeleme adımını üç kez tekrarlayın.

Aktive edilen biyo-boncukları daha fazla kullanım için üç adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak bölebilirsiniz. Önceden hazırlanmış lipid stokundan bir aliquot alın ve eritin. Hemen, tüpü 7.000g sıcaklığında beş saniye boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjle yaparak içeriği tabandan toplan.

Lipid stokunu %60 genlikte su banyosu ile ultrason ile ultrason yapın ve aşırı ısınmayı önlemek için her beş ila 10 dakikada bir berraklık ve sıcaklığı izleyin. Lipid stoku berrak ve şeffaf olana kadar sonikasyona devam edin. Sunulan denklemi kullanarak hedef membran proteininin molyar miktarını hesaplayın.

Daha sonra, hedef proteinin MSP'ye ve lipidin bir'e beşe ile 250'den oluşan molar stoikiyometrik oranına göre gerekli MSP ve lipid stok çözelti hacimleri hesaplanın. İlgili lipid ve MSP hacimlerini birleştirerek 300 mikrolitrelik bir ana karışım hazırlayın ve 10 dakika boyunca buzda kuluçka yapın. Sonra yoğunluğu sağlamak için nazikçe pipetle yaparak konsantre protein çözeltisine yavaşça 50 mikrolitre karışım ekleyin.

Sonra karışık karışımı bir saat buzun üzerine koyun ve tüpü her 15 dakikada bir nazikçe ters çevirerek iyice karıştırın. Şimdi, önceden aktive edilmiş biyo-boncuklardan bir aliquot alın ve kalan düşük tuzlu tamponu aspire edin. Protein çözeltisini boncuklara ekleyin ve dört derece Celsius'ta karanlıkta bir saat boyunca döndürerek kuluçka yapın.

Karışımı 7.000g sıcaklığında beş saniye boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice düşük tuzlu tampon aspirasyonu yapılan ikinci bir biyo-boncuk aliquotuna aktarın. İçeriği nazik bir ters çevirme ile iyi karıştırdıktan sonra, dört ila sekiz saat veya gece boyunca karanlıkta kuluçka yapın.

Protein çözeltisi kısa bir süreliğine santrifüjlendikten sonra, üst organı önceden aktive edilmiş biyoboncukların üçüncü aliquotuna aktarın. Karanlıkta dört derece Celsius sıcaklığında bir saat boyunca döndürerek kuluçka yapın. Kısa bir santrifüjlemenin ardından, süpernatant temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.

Agregaları çıkarmak için 17.000g sıcaklıkta dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Nanodisk TASK2 kompleksleri boyut dışlama kromatografisiyle saflaştırıldıktan sonra, elyutsiyondaki pik fraksiyonları bir araya getirilir ve bunları mililitrede 1,2 ila 1,5 miligram arasında nihai nanodisk TASK2 konsantrasyonuna konsantre edilir. Nanodisk montajını doğrulamak için, örnekleri %12 SDS-PAGE ile analiz edin ve MSP ile hedef membran proteininin varlığını doğrulayın.

Boyut dışlama kromatografi profili, 15,1 mililitrede birleştirilmiş nanodisk kompleksine ve 18,0 mililitrede serbest MSP'ye karşılık gelen iki ana zirve gösterdi. Zirve alanlarının nicelendirilmesi, birleştirilmiş nanodisk zirvesinin 147,2 alana sahip olduğunu gösterdi. Buna karşılık, serbest MSP zirvesi 31,5 alana sahipti; bu da hedef proteinin %82,4 montaj etkinliğine karşılık gelir ve SDS-PAGE'deki MSP, tek bir nanodisk kompleksine dahil olmalarını doğruladı.

Bu protokol, araştırmacıların nanodisk dizisi yapısı kullanarak membran protein yapısını incelemelerine yardımcı olur. En zor kısım, membran proteini, MSP ve lipidlerin oranını optimize etmektir. Bu prosedürle fonksiyonel testler, yüzey plazmon rezonansı ve kütle spektrometrisi de yapılabilir.