Kendi Kendini Oluşturan İnsan Kardioidlerinde Hipoksi-Reoksijenlenme Yaralanma Modeli

Araştırmalarımız, yaralanma sonrası kalbin yenilenmesine yardımcı olacak yeni yollar bulmaya odaklanıyor. Bunun için kendi kendine oluşan kardiyak organoidler üretiyoruz ve hipoksi-reoksijenasyon çalışmaları yürütüyoruz. Bu protokol, yaralanma yanıtı çalışmak, yenilenmeyi teşvik etmek için terapötik müdahaleler için uygulanabilir ve hastaya özgü hastalık modellemesi için kullanılabilir.

Başlamak için, D1 kardiyak mezoderm spesifikasyon ortamını aspire edin ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre türemli kardiyak mezoderm hücrelerini tamamen kapsayacak kadar hücre ayrılma çözeltisi ekleyin. Sonra tabağı 37 derece Celsius sıcaklığında bir kuluçka makinesine beş dakika koyun. Bir pipet kullanarak, her kuyuya eşit hacimde D2 kardiyak mezoderm ortamı ekleyin ve yapışan hücreleri serbest bırakmak için yukarı aşağı nazikçe pipet yapın, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Santrifüj kullanarak, hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300G ile pellet edin. Pellet, beş mikromolar IWP-2 ve mililitrede 50 mikrogram askorbik asit içeren bir mililitre D2 kardiyak mezoderm spesifikasyon ortamında yeniden askıya alın. 10 mikrolitre trypan mavisi ile 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu mikrotüpte karıştırın.

Hücreleri tercih edilen sayma yöntemiyle sayın, ardından hücreleri iki mikromolar tiazovivin ile takviye edilmiş D2 kardiyak mezoderm spesifikasyon ortamında mililitrede 100.000 hücre konsantrasyonuna kadar seyreltin. Hücre süspansiyonunu uygun boyutta bir reaktif rezervuarına aktarın. Daha sonra, çok kanallı pipet kullanılarak, ultra düşük bağlantılı 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 mikrolitre dağıtılır ve her kuyu başına 10.000 hücre konsantrasyonu elde edilir.

Plakayı 500G oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürerek süspansiyon kültüründe insan kalp organoidi oluşumunu tetikleyin. Her kuyunun içinde büyük, iyi sınırlanmış bir hücre pelletinin oluşumunu gözlemleyin. Eğer pellet sınırlandırılmamışsa, santrifüjasyonu tekrarlayın.

24 saat sonra, beş mikromolar IWP-2 ve mililitrede 50 mikrogram askorbin asit içeren 10 mililitre D3 ortamı RB eksi plaka başına hazırlanır. Çok kanallı pipet kullanarak, her kuyuya 100 mikrolitre D3 ortamı ekleyin ve mevcut ortamları çıkarmayın. Ertesi gün, her kuyudan 100 mikrolitre D3 ortamı çıkarın.

Aspirasyon riskini en aza indirmek için, plakayı 45 derece açıya çevirin ve çok kanallı pipeti plakanın yan duvarına 90 derece açı ile tutun. Pipeti kuyu duvarına sıkıca yerleştirin ve yavaşça aspirasyon yapın. Medya çıkarıldıktan sonra, RB eksi içinde beş mikromolar IWP-2 içeren 100 mikrolitre D4 ortam ile değiştirin.

Ucu kesilmiş 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, insan kalp organoidleri 1,7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır. Organoidlerin tüpün dibine batmasına izin verin ve fazla ortamı nazikçe çıkarın. Organoidleri bir kez yıkamak için fosfatla tamponlanmış tuzlu su ekleyin.

Birkaç saniye bekleyin ve fazla PBS'yi nazikçe çıkarın. Sonra, organoidleri sabitlemek için %4 paraformaldehit ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yerleştirin ki fiksasyon sağlansın. Daha sonra istenen sayıda sabit organoidi 1,7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Fiksatif çözeltiyi çıkarın ve organoidleri %0,1 Tween 20 içeren PBS ile yıkayın. Birincil antikor çözeltisini, antikoru istenen konsantrasyona boyama çözeltisinde seyreltirerek hazırlayın. Bir pipet kullanarak, her mikrosantrifüj tüpüne 50 ila 100 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin, böylece organoitlerin tamamen kaplı olduğundan garanti olun.

İnkubasyon ve ardından yıkama işlemlerinden sonra, numuneyi ikincil antikorla 24 saat boyunca dört derece Celsius sıcaklığında bir sallama platformunda boyama çözeltisinde sulandırın. Kuluçkadan sonra, daha önce tarif edildiği gibi yıkamalar yapın. Sonrasında, kesilmiş bir pipet ucu kullanarak organoitleri pozitif yüklü cam sürgüye aktarın.

Fazla PBS'yi Tween 20 ile nazikçe çıkarın ve organoidleri kapatmak için birkaç damla montaj ortamı ekleyin. Organoidlerin üzerine dikkatlice bir örtü yerleştirerek düzleştirin. Sonra floresan mikroskopisi yapılmasına devam eder.

Sabit organoidleri dört derece Celsius'ta %30 sakarozda gece boyunca inkubasyon yaptıktan sonra, bunları plastik bir kalıba aktarın ve kalıba organoidleri örtecek kadar küçük bir damla optimal kesme sıcaklığı bileşiği ekleyin. İnce cımbız veya pipet ucu kullanarak, organoidleri bileşik içindeki yumruk parçalarını nazikçe yeniden konumlandırın, böylece küfür kesilmemiş ve kalıbın kenarlarından uzak kalsınlar. Organoidleri kalıbın altına mümkün olduğunca yakın konumlandırarak tek bir kriyoseksiyonda bulunan sayısı en üst düzeye çıkarabilirsiniz.

Kalıpı, optimum kesme sıcaklığı bileşiğinin ilk katmanını dondurmak için kuru buz tabakası içeren bir strafor soğutucuya yerleştirin. Bileşiğin sertleşmesini birkaç dakika bekleyin, sonra kalıpı tezgaha taşıyın. Kalıp dolana kadar ek optimal kesme sıcaklığı bileşiği ekleyin.

İlk tabakanın tamamen erimesine izin verin, ardından kalıp kuru buza geri dönüp donmayı tamamlayacak. Dondurulduktan sonra kalıpları -80 derece Celsius sıcaklığında saklayabilir veya altı mikrometrelik kesitler elde etmek için kriyoseksiyona geçebilirsiniz. Bir pipet kullanarak, 96 kuyu kapasiteli insan kalp organoid plakası başına beş mililitre hipoksi ortamını hücre kültürü şölesine aktarın.

Matayı bir hipoksi odasına yerleştirin ve odayı %5 karbondioksit ve %95 azot içeren anoksik gazla üç dakika boyunca yıkayın. Odayı hipoksi başlatmadan önce en az bir saat boyunca 37 derece Celsius sıcaklıkta bir kuluçka makinesine yerleştirin. Çok kanallı pipet kullanarak, insan kalp organoid plakasının tüm kuyularından yaklaşık 150 mikrolitre ortam çıkarın.

Sonra, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, kalan maddeleri organoidleri rahatsız etmeden dikkatlice her bir kuyunun içinden çıkarın. Her kuyuya 50 mikrolitre hipoksi ortamı ekleyin. İnsan kalp organoid plakasını hipoksi odasına yerleştirin.

Ve odayı %5 karbondioksit ve %95 azot içeren anoksik gazla üç dakika boyunca yıkayın. Hipoksi odasını 37 derece Celsius sıcaklıkta altı saat boyunca kuluçka kutusuna yerleştirin. Reoksijenasyonu başlatmak için, insan kalp organoidlerini hipoksi odasından çıkarın.

Çok kanallı pipet kullanarak, her kuyuya 150 mikrolitre önceden ısıtılmış RB+ortam ekleyin. Son olarak, plakayı 37 derece Celsius sıcaklıkta bir kuluçka makinesine yerleştirin ve aşağı akış testleri yapılmadan önce en az üç saat reoksijenlenme yapılmasına izin verin. Altı saatlik hipoksi ve 24 saatlik reperfüzyonun ardından, yaralı insan kalp organoidlerinde hücre dışı laktat dehidrojenaz aktivitesi, yaralanmamış kontrol organoidlerine kıyasla anlamlı şekilde artmıştır.

Hipoksi ile tedavi edilen kardiyak organoidlerde TUNEL-pozitif kardiyomiyosit çekirdekleri bulundu ve TUNEL-pozitif kardiyosiyt çekirdeklerinin oranı, yaralı organoidlerde yaralanmamış kontrollere göre anlamlı derecede yüksekti. Reoksijenlenmeden önce hipoksi süresi arttıkça yara oluşumunda zamana bağlı bir artış gözlemlenmiştir. Reperfüzyon sonrası 24 saat sonra, yaralanmamış insan kalp organoidlerinin %69'u atıyordu, oysa yaralı organoidlerin hiçbiri atmıyordu.

Yaralanmamış insan kalp organoidleri, ilgi çekici beş bölgede senkronize kalsiyum geçişleri sergiledi; zirveler aynı anda ve benzer dalga formlarına sahipti. Yaralı insan kalp organoidleri koordineli kasılmalar göstermedi ve ilgilenilen bölgelerde düzensiz spontan kalsiyum geçişleri gösterdi. Bu protokol, araştırmacıların iPSC kaynaklı insan kalp organoidlerinde miyokard enfarktüsünü taklit etmesine olanak tanır.

Tekrarlanabilir yaralanmayı sağlamadaki en büyük teknik zorluk, mevcut medyanın tamamen kaldırılmasıdır. Gelecekteki çalışmalarımız, insan kardiyak organoid modellerinde doku yenilenmesini teşvik edebilecek faktörleri belirlemeyi hedeflemektedir.