Balina İzleme Gemileri için Çevresel DNA Örnekleme Örneği

Bu protokol, balina gözlem turları sırasında balina eDNA örneklemesi için standartlaştırılmış bir yaklaşım sunar. Birçok farklı eDNA örnekleme yöntemi mevcuttur. Bu, karşılaştırmalı veri analizini engeller.

Protokolümüz çevresel koşullar ve kirlenmeye karşı korumalar açısından optimize edilmiştir. Bir eDNA radyo laboratuvarının desteğiyle, bu protokol uzman olmayanlar ve vatandaş bilim insanları tarafından balina gözlem faaliyetleri sırasında ve dünya çapında uygulanabilir. Başlamak için, saha veri sayfaları ve deniz deniz hayvanları çevresel DNA örneği için lamine edilmiş adım adım saha protokolü dahil olmak üzere saha dokümantasyon materyallerini hazırlayın.

Kutuya su geçirmez bir işaretleyici, her flukeprint için iki eDNA filtresi, yeterli sayıda eldiven ve özel bir atık konteyneri koyun. Gemi tipine ve gemi konfigürasyonuna uygun bir veya daha fazla sert kova, ikincil bir çevresel DNA kabı ve taşınabilir bir peristaltik veya vakum su pompası hazırlayın. Tüm ekipman kullanımında eldiven takın ve görevler arasında eldiven değiştirin.

Ekipmanı sterilize etmek için, kovaların, kapakların, kapların ve pompa borusunun tüm yüzeylerine eşit şekilde sıçratarak seyreltilmiş ev çamaşır suyu çözeltisi uygulayın. Musluk suyla üç kez iyice durulayın. Yolcular gelmeden önce tüm malzemeleri gemiye alın ve belirlenmiş temiz bir alanda saklayın.

Geminin örnekleme zamanlaması ve konumlandırılmasını gemi mürettebatıyla koordine edin. Balina dalışlarını önceden tahmin etmek için su üzerindeki yüzey desenlerini gözlemleyin. Flukeprint'ten mümkün olan en kısa sürede 20 litre deniz suyu topla, balina dalışından sonra 10 dakikadan fazla gecikme yaşamayın.

Her konum ve gemi türüne uygun özelleştirilmiş lojistik koşullar kullanarak çeşitli bölgelerden örnekler alın. Gerekirse, toplanan suyu gemideki belirlenmiş bir filtrasyon istasyonuna taşıyarak dökülmeyi önleyin. Tür kimliği, coğrafi konumlandırma sistemi koordinatları, zamanı ve örnek kopyalama tanımlamasını veri sayfasında kaydedin.

Filtreleme öncesi eldivenleri değiştirin. Filtre torbasını açın ve filtreyi sadece prizden tutun. Girişi şnorkele yerleştirin, ardından pompa borusunu çıkışa bağlayın.

Şnorkeli filtre yuvasını batırmadan su örneğine batırın ve pompayı hızlı ve sabit bir akış hızına ayarlayın. Akış stabilitesini izlerken sürekli olarak 10 litre filtreleyin. Sonra, filtreyi ters çevirip kalan suyu çıkarmak için pompayı 30-60 saniye çalıştırın.

Filtreleme pompası kurulumunu saha koşullarına göre özelleştirin. Pompayı kapatın ve boruyu çıkarın. Filtreyi orijinal poşetine koyup hemen etiketleyin.

Eldivenleri değiştirin ve ikinci replikasyon için filtrasyon yapmaya hazırlanın. Kendini koruyan çevresel DNA filtrelerini, gölgeli, ortam sıcaklığında güvenli ve kuru bir kapta saklayın. Ortam sıcaklığı 20 derece Celsius'u aşarsa filtreleri buzdolabında saklayıp üç ay içinde gönderin.

Tüm laboratuvar işlemlerini yeterli havalandırmaya sahip özel ultraviyole sterilize odalarda gerçekleştirin. DNA içermeyen eldiven ve koruyucu giysiler giydikten sonra çalışma tezgahlarını iyice temizleyin. DNA-içermeyen forseps kullanarak, filtre zarını üçgenlere katlayın ve ucu aşağıya doğru yönelmiş iki mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın.

Her reaksiyon tüpüne 380 mikrolitre TES tamponu ve 20 mikrolitre proteinaz K içeren 400 mikrolitre liz tamponu ekleyin. Vortex kısa süreliğine 56 derece Celsius'ta en az üç saat boyunca kışkırtma ile kuluçka içinde. Filtreyi delikli tabanlı plastik bir girişe yerleştirin ve oda sıcaklığında 18,626G sıcaklığında santrifüj yapın, böylece liz tamponunu filtreden ayırın.

Pipet ekstraksiyon reaktifleri yıkama plakalarına ve elusiyon plakalarına dönüştürülür. Toplam lizat hacmi 300 mikrolitreyi azarsa, birden fazla bağlama plakası kullanın. Vortex manyetik parçacıkları ile ilk bağlayıcı plakaya her kuyuya 30 mikrolitre ekleyin.

İki bağlayıcı plaka için ön DNA alım programını ve ardından robotta DNA çıkarma programını çalıştırın. Tüm QPCR reaksiyonlarını üçlü olarak çalıştırmak için, gerekli ana karışımı özel bir çalışma alanında hazırlayın ve kuyular arasında dağıtın. Her kuyuya üç mikrolitre hedef DNA standardı veya eDNA ekstraktı ekleyin.

Hazırlanan PCR plakası mühürlendikten sonra, 3.500G ile 10 saniye boyunca santrifüjlenin ve plakayı gerçek zamanlı nicel PCR termosiklene yerleştirin. Son olarak, testi optimize edilmiş döngü koşullarında yapın. İzlanda'nın Skjalfandi Körfezi ve Azor Adaları'nda 247 çevresel DNA veya eDNA örneği toplandı; her flukeprint için iki kendini koruyan eDNA filtresi ile 10 litreye kadar deniz suyu toplandı.

Kambur balina eDNA'sı için analiz edilen 44 eDNA filtresinden 20'si amplifikasyon sinyali verirken, 24'ü hiç amplifikasyon göstermedi. Ekstraksiyon boşlukları, alan kontrolleri ve nicel PCR kontrolleri tespit edilebilir bir amplifikasyon göstermedi, bu da kontaminasyon olmadığını gösteriyordu. Olumlu reaksiyonlar arasında, dokuz eDNA filtresi tespit sınırının altında en az bir döngü eşik değeri verdi ve güvenilir tespitler olarak sınıflandırıldı.

Kalan 11 EDNA filtresi, tespit sınırının üzerinde döngü eşik değerleri üreterek makul tespitlerin mümkün olduğunu gösteriyordu. Azorlar eDNA filtrelerinde ortalama döngü eşik değeri, İzlanda filtrelerinde yaklaşık 36,9 değerine kıyasla yaklaşık 34,7 ile biraz daha düşüktü. Azor Adaları ile İzlanda eDNA filtreleri arasındaki döngü eşik değerlerindeki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi.

Bu protokol, deniz biyolojik çeşitliliği veya balina popülasyonu genetiğini araştırmak için gelecekteki büyük ölçekli eDNA örnekleme kampanyalarında kullanılabilir. Bu protokol, balina izleme gemilerinden toplanan fluke izlerinde bulunan eDNA aracılığıyla deniz ve aynı zamanda bulunan taksonların istilavsiz olarak tespit edilmesini ve izlenmesini sağlar.