Name: CAR T Hücrelerinin Fonksiyonel Profillenmesi için Boncuk Tabanlı Çoklu Akış Sitometrisi Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Öğrenin, boncuk tabanlı çoklu akış sitometrisi ile insan CAR T hücrelerinin fonksiyonel profillenmesini. Bu yöntem, sınırlı örneklerden çoklu etkili moleküllerin eşzamanlı tespitini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>Akış sitometrisi için boncuk tabanlı multipl sitokin analizi</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>MACSPlex verilerinin otomatik kapılama ve analizi için web tabanlı araç</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Akış Sitometrisi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>Multipl veri ölçümünün akış sitometrisi cihazı</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Akış Sitometrisi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>Multipl veri ölçümünün akış sitometrisi cihazı</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Modu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Otomatik kapılama ve analiz için yazılım</td></tr><tr><td>TexMACS Ortamı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>İnsan ve fare T hücrelerinin kültürü ve çoğaltılması için geliştirilmiş optimize edilmiş serumsuz hücre kültürü ortamı</td></tr></tbody></table>

car t hücrelerinin fonksiyonel profillenmesi için boncuk tabanlı Çoklu akış sitometrisi testi

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

CAR T Hücrelerinin Fonksiyonel Profillenmesi için Boncuk Tabanlı Çoklu Akış Sitometrisi Testi

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

Araştırmalarımız CAR T hücresi fonksiyonel karakterizasyonuna odaklanmaktadır ve efektör molekül salınımının profillenmesi için akış sitometrisi ile uyumlu bir multipleks analiz yöntemi geliştirilmiştir. Bu prosedür; fonksiyonel karakterizasyon, mekanistik incelemeler, kalite kontrol (QC) testleri ve potens değerlendirmesi amacıyla CAR T hücresi araştırmalarında uygulanabilir.Başlamak için, mühendislik ürünü insan kimera antijen reseptörü T veya CAR T hücrelerinin kültürlerini, hedef hücrelerle (ilgili antijeni eksprese eden veya etmeyen) 2,5'e 1 efektör-hedef hücre oranında hazırlayın. Salgılanan sitokinleri analiz etmek veya belirli bir zaman diliminde sitokin kinetiğini izlemek için süpernatan toplama için bir veya birden fazla zaman noktası belirleyin.Pelete 200 µL tampon veya hücre kültürü medyumu ekleyerek analit standardını yeniden çözün ve nazikçe karıştırın. Altı adet reaktif tüpü hazırlayın ve yeniden çözünmüş standardı 3.2 pg/mL veya 0.6 pg/mL'ye kadar bir ila beş oranında seyreltme serisi şeklinde hazırlayın. Bir kör numune hazırlayın. Ko-kültür sonrası belirlenen saatlerde, ko-kültürü 21 °C'de beş dakika boyunca 300 g'de santrifüjleyin. Süpernatantları doğrudan kullanın veya standart eğri aralığına uyması için seyreltin.Bir MACSPlex filtre plakadaki kuyucuk başına 200 µL MACSPlex tamponu ekleyerek ön ıslatma yapın ve kuyucuklar boşalana kadar aspire etmek için bir vakum manifoldu veya santrifüj kullanın. Boncukların tamamen süspande olması için yakalama boncuk karışımını vorteksleyin. 96 kuyucuklu bir filtre plakanın kuyucuklarına 50 µL standart veya numune ve 20 µL ön seyreltilmiş boncuk ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında, karanlıkta, 450 rpm hızında çalkalayarak iki saat boyunca inkübe edin. Kuyucukları bir vakum manifoldu kullanarak 200 µL tampon ile iki kez yıkayın. Kuyucuklara 1 ila 50 oranında ön seyreltilmiş 100 µL saptama reaktifi 1 ekleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 450 rpm hızında çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin. Kuyucukları iki kez yıkayın. Kuyucuklara 1 ila 50 oranında ön seyreltilmiş 100 µL saptama reaktifi 2 ekleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 450 rpm hızında çalkalayarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Kuyucukları bir kez yıkayın ve numuneleri 200 µL tampon içinde yeniden süspande edin.Edinim ayarlarını MACSQuant akış sitometresine yüklemek için yakalama boncukları flakonundaki 2D barkodu kullanın. Yazılıma giriş yaptıktan sonra, örnek rafı olarak MACSPlex filtre plakasını seçin. 2D kod okuyucuyu etkinleştirmek için araç çubuğundaki Barkod düğmesine tıklayın. Flakonu, barkod yanıp sönen ışığa bakacak şekilde 0,5 ile 2,5 santimetre mesafede okuyucuya tutun. Autolabel sekmesinde, Yakalama Boncuklarını MPx human cytotoxic T, and, natural killer cell olarak atayın ve Nolabel seçeneğini belirleyin. Sitotoksik T ve doğal öldürücü hücre standardının seri dilüsyonları için grup pozisyonlarını tanımlayın. Settings sekmesinde, Express Mode seçeneğini belirleyin. Türü Analysis ve modu MACSPlex_Standard olarak ayarlayın. Ardından hafif karıştırma uygulayın. Bilinmeyen örneği benzer şekilde atayın ve pozisyonlarını tanımlayın. İsteğe bağlı olarak örnekleri gruplandırın; örnek tanımlayıcılarını ve açıklamalarını girin. Settings sekmesinde tekrar Express Mode seçeneğini seçin. Türü Analysis ve modu MACSPlex_Sample olarak ayarlayın. Deney tablosunda, raf tanımlamalarının doğru olduğunu doğrulayın. Filtre plakası kuyucuklarındaki sıvı seviyelerinin uygun olduğundan emin olun ve ölçüme başlayın. Mavi ve kırmızı lazerlerle donatılmış bir akış sitometresinde, fizkoeritrin veya PE, floresein izotiyosiyanat veya FITC ve allofikosiyanin veya APC kanallarını kullanarak veri edinin. MACSQuant akış sitometresinde otomatik kapılama ve veri analizi için express mode şablonlarının kullanıldığını onaylayın. Alternatif olarak, otomatik kantitatif sitokin ölçümü ve dışa aktarıma hazır sonuçlar için FSC veya MQD veri dosyalarını web tabanlı InspectoR aracına yükleyin. FITC'ye karşı PE kanalında 12 farklı yakalama boncuğu popülasyonunun düzgün ayrıldığını doğrulayın. Sitokin konsantrasyonlarını hesaplamak için standart eğriyi uygulayın. Son olarak, sonuçları dışa aktarın ve görselleştirin.Multiplex boncuk kodlaması kullanılarak, bireysel analitleri temsil eden farklı boncuk kümeleri biyaksiyel grafikte net bir şekilde çözümlenmiştir. Tümör hedef hücreleri ile birlikte kültüre edilmenin ardından, CAR T hücreleri yüksek seviyelerde granzyme B, interferon gamma veya INF-gamma, tümör nekroz faktörü alfa veya TNF-alpha ve granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör veya GM-CSF salgılamış; bu durum güçlü aktivasyon ve sitotoksik efektör fonksiyonuna işaret etmiştir. İnterlökin-2 veya IL-2 seviyeleri, güçlü proliferatif sinyalleme ile uyumlu olarak üst tespit limitini aşmıştır. IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 ve monosit kemoatraktan proteini 1 veya MCP-1 dahil olmak üzere düzenleyici veya alternatif yardımcı T hücresi yanıtları ile ilişkili sitokinler, düşük veya tespit edilemeyecek kadar yakın seviyelerde bulunmuştur. CAR T hücreleri, antijen-pozitif hedeflerin tanınması üzerine, 8 ila 24 saat içinde granzyme B, IFN-gamma, TNF-alpha, GM-CSF ve IL-2'nin güçlü yukarı regülasyonu ile hızlı ve güçlü bir sitokin salınımı sergilemiş ve 48. saate kadar zirve seviyelere ulaşmıştır. IL-6, IL-17A, IL-21 ve perforinde de orta derecede artışlar gözlemlenmiştir. IL-4, IL-10 ve MCP-1 düşük kalmış veya hafifçe yükselmiştir. Antijen-negatif hedeflerle yapılan birlikte kültürler, tüm analitlerde minimal sitokin indüksiyonu göstermiştir.Bu protokol, CAR T hücresi aktivasyonunu ve efektör fonksiyonunu yansıtan sitokinlerin, kemokinlerin ve sitotoksik mediyatörlerin kantifikasyonuna olanak tanır. Bu protokoldeki en önemli hususlar ko-kültür süresi, efektör-hedef oranı, numune dilüsyonu ve ölçülebilir analit seviyelerinin korunmasıdır. Bu prosedürün ardından, süpernatan profilleme; akış sitometrik analizler, CAR T hücresi fenotipleme veya sitotoksisite assayleri ile eşleştirilebilir.

bead-based-multiplex-flow-cytometry-assay-for-functional-profiling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Bu video, bir numunedeki birden fazla sitokin hedefini ölçmek için multipleks boncuk tabanlı bir immünolojik testi gösterir. Numunede bulunan sitokinleri bağlamak için sitokin spesifik antikorlara konjuge edilmiş farklı mikrokürelerin bir karışımı kullanılır. Streptavidin etiketli raportörler, biyotinile edilmiş tespit antikorları kullanılarak bağlı sitokinler üzerinde immobilize edilir. Akış sitometrisi, mikrokürelerin benzersiz boyutlarına ve iç floresan yoğunluklarına dayalı olarak bağlı...

Çoklu Sitokin Hedeflerini Ölçmek için Multipleks Boncuk Bazlı İmmünoassay

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Sitokinler çeşitli oküler hastalıklar eğitim yardımcı olur gözyaşı film analizi. Boncuk dayalı multiplex deneyleri basit ve hassas ve küçük hacimli örneklerde birden çok hedef test etkinleştirin. Burada biz bir protokolü kullanarak bir profil oluşturma gözyaşı film sitokin için tarif boncuk dayalı multiplex tahlil.

Boncuk Multiplex tahlil için gözyaşı sitokin profilleri analizi dayalı

Bu iletişim kuralı birden fazla sitokin hedeflerin aynı anda doku kültürü supernatants multiplex boncuk tabanlı immunoassay platform ve bir Akış Sitometresi kullanarak uyarılmış fare splenocytes toplanan miktar açıklar.

Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize...

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Akış sitometri T hücreleri içinde kromatin durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol, bilim adamları, floresan Histon H3 antikorların ortalama florasan yoğunluğu (MFI) bir artış gösterdiği, T hücresi aktivasyonu sırasında kromatin yoğunlaşması kanıt yorumlama sağlar...

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

Öğrenin, boncuk tabanlı çoklu akış sitometrisi ile insan CAR T hücrelerinin fonksiyonel profillenmesini. Bu yöntem, sınırlı örneklerden çoklu etkili moleküllerin eşzamanlı tespitini sağlar.

CAR T Hücrelerinin Fonksiyonel Profillenmesi için Boncuk Tabanlı Çoklu Akış Sitometrisi Testi

Daha fazla video keşfet