Nörogelişim üzerindeki prenatal iltihabı değerlendirmek için erken gebeliksel anne immün aktivasyon fare modelinin oluşturulması

Laboratuvarımız, doğum öncesi iltihabın mikroglia biyolojisini nasıl değiştirdiğini inceliyor; beynin bağışıklık hücreleri olumsuz nörogelişimsel sonuçlara katkıda bulunuyor. Mevcut mikro mühendislik modelleri orta gebeliğe odaklanır. Ancak, hayatta kalma ve tutarlılığı artırmak için kalite kontrol metriklerini de içeren erken bir gebelik protokolü sunuyoruz.

Model, çevresel iltihaplanmanın beyin gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için herhangi bir vahşi tip veya genetik fare modeline uygulanabilir. Başlamak için, öğleden sonra veya akşam geç saatlerde iki sekiz ila 10 haftalık C57 BL6 dişi faresini C57 BL6 yetiştirici erkeklerle birlikte yerleştirin. Ertesi sabah, dişi farelerde vajinal tıkaç için değerlendirin ve tıkanma gerçekleşene kadar günde bir kez kontrol etmeye devam edin.

Tıplar geçici ve sabah kontrol edilmezse öğleden sonra düşebilir. Vajinal tıkaç doğrulandıktan sonra, dişi fareyi tartın ve hamilelik durumunu takip etmek için kilo alımını takip ederek ağırlığını kaydedin. Takılan dişileri bireysel kafeslere ayırın ve onları standart barınma koşullarında, yiyecek ve suya ima kadar erişimle muhafaza edin.

Tıkanmış dişileri embriyonik gün 0.5 olarak belirleyin ve gebelik yaşının doğru izini sağlamak için vajinal tıkaç tarihini kaydedin. Liyofilize poli IC'yi yüksek konsantrasyonlu bir stok çözeltisine dönüştürmek için, üreticinin talimatlarına göre steril tuzlu veya steril suda çözebilirsiniz. Vortex, yüksek konsantrasyonlu stok çözeltisi.

Sonra, düşük konsantrasyonlu bir stok oluşturmak için çözeltiyi tuzlu suyla seyreltirin. Tekrarlanan donma eritme döngülerini önlemek için, düşük konsantrasyonlu stoktan yaklaşık 125 mikrolitreyi 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve tüpleri 20 derece veya 80 derece Celsius'ta saklayın. Embriyonik günde enjeksiyondan hemen önce, 9.5.

Düşük konsantrasyonlu poli IC stokunu steril salinle seyreltirerek çalışma konsantrasyonu elde edin. Çift zincirli ribonüklein asit yapısının doğru şekilde yeniden ainlanmasını sağlamak için çalışma stokunu 65 derece Celsius'ta 10 dakika ısıtın. Sonra enjeksiyondan önce homojen bir karışım elde etmek için çözeltiyi vorteks veya pipet ile geçirin.

Hamileliği doğrulamak için, embriyonik gün sabahı 9.5 sabahı tartın. Anne bağışıklık aktivasyonu (MIA) için poli-IC enjeksiyon hacmini ve kontrol organları için %0,9 salin enjeksiyon hacmini hesaplayın. Hazırlanan poli-IC çalışma çözeltisi veya salinin uygun hacmini steril 27 gauge veya daha küçük bir şırıngaya çekin.

Şimdi, acı ve sıkıntıyı en aza indirmek için barajı doğru şekilde tutun. Poli-IC asidi veya salin, kalça seviyesinin hemen üstünde sol veya sağ alt kvadranta veya ikinci meme setine intraperitoneal enjekte ediliyor. Sonra şırıngaları BioSafety Sharps kapına atabilirsiniz.

Ayrıca, kohort boyunca tutarlılığı korumak için enjeksiyon tarafını kaydedin. Barajı hemen ev kafesine geri götürün ve herhangi bir sıkıntı belirtisi olup olmadığını izleyin. Enjeksiyondan sonra en az 24 saat boyunca kafese hidrojel ekleyin, böylece hastalık davranışıyla ilişkili susuzluğu önleyin.

Bundan sonra, poli-IC doz enjeksiyon hacmini, enjeksiyon tarihi ve saatini, gebelik yaşını ve poli IC parti numarasını kaydedin. Enjeksiyondan üç saat sonra, her fareyi bir dakika boyunca tek tek gözlemleyin ve azalan aktivite, kambur duruş, yüz yüz yüzü buruşması veya sulu dışkı gibi davranışları üç puanlık bir ölçekle değerlendirin. Bu davranışlardan birini veya birkaçını sergileyen fareleri akut hastalık davranışları olarak sınıflandırın.

Sonrasında, kuyruk kanası gibi minimal invaziv bir yöntemle, enjekte edilen damdan dikkatlice anne kanı toplanır. Yaklaşık 50 mikrolitre kan toplayın. Hemostaz doğrulandıktan sonra barajı ev kafesine geri götürün.

Toplanan kanı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca pıhtı bırakın. Numuneyi oda sıcaklığında 2000 G'de beş dakika boyunca santrifüjlenerek serumu pıhtı parçasından ayırın. Numuneyi tekrar santrifüjlendikten sonra, pıhtı rahatsız etmeden şeffaf üst serum tabakasını dikkatlice toplayın.

Serumu 20 derece Celsius sıcaklığında sakla, sonraki sitokin analizine hazır olana kadar sakla. Enjeksiyondan sonra, poli IC aside verilen yanıtı izlemek için damjaları üç gün boyunca günlük tartın. Beklenen partürasyon gününde, başarısız gebelik göstermek için yavru büyüklüğü, yavru canlılığı veya yavru olmaması gibi kum sonuçları kaydedilir.

Ölen yavruları derhal çıkarın ve kurumsal biyolojik güvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf edin. IL-6 ve TNF-alfa gibi inflamatuar sitokinleri MIA sonrası veya üreticinin talimatlarına uygun kontrol enjeksiyonlarında IL-6 ve TNF-alfa gibi inflamatuar sitokinleri niceliklerini ölçmek için ELISA veya multipleks testleri kullanın. Nicel hesaplamadan sonra, sonuçları kullanarak MIA yanıtı için temsil edici bir eşik belirler.

Son olarak, yazılımımızı kullanarak anne serumu IL-6 ile TNF alfa seviyeleri arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için istatistiksel bir analiz yapın. Embriyonik gün 9.5'te poli IC uygulamasının ardından, MIA damları kontrol damlarına göre IL-6 seviyelerinde anlamlı artış gösterdi. TNF alfa seviyeleri, anne IL-6 seviyeleriyle güçlü pozitif bir korelasyon gösterdi.

Embriyonik gün 0.5 ile embriyonik gün 9.5 arasında, başarılı bir yavru doğuran anneler, yavru üretemeyen annelere göre önemli ölçüde daha fazla kilo aldı. Enjeksiyondan bir gün sonra, kayıp damlar kilo verdi, tuzlu su ile tedavi edilen kontrol damları ise kilo aldı. Ancak embriyonik 12. güne gelindiğinde, her iki grup da benzer kilo artışı gösterdi.

Hamilelik öncesi kilo, tuzlu su ile tedavi edilen kontrol veya kayıp damlarda kum etkililiğini etkilemedi. Ancak, Jackson Labs'tan alınan C57 BL6 fareleri, Michael işlemi sırasında Charles River'dan alınan C57 BL6 farelerinden daha başarılı yavrulara sahipti. Buna karşılık, poli IC'nin kaynağı kum etkinliğini etkilemedi.

Ayrıca, Jackson Labs'tan alınan hayvanlar, serum IL-6 ile ölçülende Charles River'dan alınan hayvanlara kıyasla daha güçlü bir anne inflamatuar yanıtı göstermiştir. Buna karşılık, farklı poli IC kaynakları arasında anne inflamatuar yanıtı aynıydı. Protokol, erken MIA modelinin tekrarlanabilir oluşturulmasına ve anne iltihabının şiddetinin yavruların deneysel sonuçlarıyla korelasyonuna olanak tanır. Tüm damjalarda ayrıntılı kayıtların tutulması, reaktif parti sayılarının takip edilmesi ve tekrarlanabilir sonuçlar için anne sitokin yanıtlarının değerlendirilmesi kritik öneme sahiptir.