Karaciğer Fibrozisi Fare Modellerinde Hepatik Yıldız Hücre Morfolojisinin Haritalanması

Bu protokol, sağlam karaciğer dokusunda karaciğer stellat hücrelerinin morfolojisini görselleştirmek ve modellemek için kapsamlı bir görüntüleme hattı sunar. Mevcut 2B görüntüleme tam yıldız hücre morfolojisini eksik, yapısal ve fonksiyonel içgörüleri sınırlamaktadır. Bu protokol, karmaşık 3D mimarinin sağlam bir şekilde yakalanmasını sağlar.

Başlamak için, anestezi altında olan bir farenin avuçlarını sıkarak doğru anestezi yapın. Karın bölgesine %70 etanol sprey ile kürkü ıslatın. Bir çift pensle karın bölgesinin ortasındaki deriyi arka bacaklarla hizalanmış şekilde alıp deriyi kesmeye başlayın, böylece karın bölgesi ortaya çıkarılır.

Sonra PBS ile ıslatılmış pamuklu çubuklarla bağırsakları ve diğer organları yan tarafa taşıyıp sol lobu kaldırın. Sol lob ile kaudat lob arasına bağlı zarı dikkatlice kesin. Sonra sol lobun üst tabanını bir dikiş ile bağlayın.

Sol lobu dikiş düğümünün altındaki kısmı kesin ve doku örnekleri toplama ve işleme için bir kenara bırakın. Karaciğeri hareket ettirmek ve portal veneri ortaya çıkarmak için PBS ile ıslanmış pamuk çubukları kullanın. Sonra kateter iğnesini dikkatlice portal venin uzunluğunun yaklaşık yarısına sokun.

Kateter iğnesini çıkarın. Kateterden kanın geri akışını sağlayarak başarılı takıntıyı gösterin. Çalışan perfüzyon pompasından doldurulan tüpü katetere bağlayın ve karaciğeri 20 mililitre PBS ile perfüze edin.

PBS'nin kalpten geçmesini önlemek için karaciğerin üzerindeki akciğer arterini hemostatla kelepçe edin. Basınç birikimini azaltmak için alt vena kava kesin. Pompa hızını dakikada beş mililitre ayarlayın.

15 dakika sonra, pompayı durdurup rezervuarı %4 paraformaldehit olarak değiştirin, ardından karaciğeri 25 mililitre %4 paraformaldehit ile perfüze edin. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, bağlayıcı dokuları keserek çevredeki organlardan karaciğeri alın. Karaciğeri, 25 mililitre %4 paraformaldehit içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Tüpü yatay olarak, gece boyunca soğuk bir odada, dört derece Celsius'ta dakikada 1.5 devirde yatay olarak yerleştirin. Ertesi gün, karaciğeri PBS'de bir tezgah sallama platformunda, oda sıcaklığında dakikada 1,5 devir hızında 30 dakika boyunca üç kez yıkayın. Karaciğeri %0,02 sodyum azid içeren 20 mililitre PBS'ye aktarın ve dört derece Celsius'ta depolayın.

Karaciğer örneklerini yaklaşık 0,5 ila 1 santimetreküp boyutunda parçalara kesin. Karaciğer örneklerini vidalı kapaklı cam şişelere aktarın. Numuneleri, oda sıcaklığında bir saat boyunca dakikada sekiz tur sürerek suyla seyreltilmiş metanol serisinde %20-80 arasında kurutun.

Numune ağartma, permeabilizasyon, immünoetiketleme ve temizleme yapıldıktan sonra, numuneyi oda sıcaklığında dibenzil eter içinde gece boyunca kuluçka altına alın ve görüntüleme yapıldı. Örnekler, boyama sinyali kaybı olmadan dibenzil eter içinde bir yıla kadar saklanabilir. Konfokal görüntüleme için, temizlenmiş örneği 1.5 numaralı cam tabanlı 35 milimetrelik cam tabanlı bir kaba yerleştirin.

Tabağı etil sinnamat ile doldurarak numuneyi tamamen batırın. Sonra kabı konfokal mikroskopun sahnesine koyun. En parlak düzlemde bir karo görüntüsü alın ve örnekin büyük bir alanını 1024 x 1024 formatında ve 600 hızda yakalayın.

Karo görüntüsüne dayanarak, ilgi çekici bölgeleri seçerek daha yüksek çözünürlüklü bir Z-tarama elde edin. Sonra, mikroskopun desteklediği en yüksek çözünürlükte temizlenmiş dokunun tüm derinliğini kapsayan bir Z-yığını edinin; bu format 1024x1024 formatında ve 600 tarama hızında kullanılır. Fare karaciğerinin başarılı perfüzyonu ve fiksasyonu, tekdüze soluk, bej sarı bir renk elde etti.

Yanlış perfüzyon nedeniyle kan pıhtılarının koyu kırmızı veya kahverengi bölgeleri oluşuyor, bu da optik netliği azaltıyor ve bu bölgelerde yüksek arka plan sinyaline yol açıyordu. Tam optik şeffaflık, dibenzil eter içinde kuluçka sonrası elde edildi; doku temizlenmeden öncesine göre daha net görünüyordu. Yüksek çözünürlüklü Z-yığınları, bireysel hepatik yıldız hücrelerin hücre bedeninden uzanan ince dendritik süreçleri ortaya çıkardı.

Hem kontrol hem de kronik karbon tetraklorür karaciğer örnekleri konfokal mikroskopide güçlü ve stabil floresan sinyaller göstermiştir. Bu boru hattı, mikro ortamın karmaşık sunucusunda yıldızlı hücre morfolojisini tekrarlayıcı şekilde haritalarak, dendritik süreçleri ve komşu hücrelerle mekansal ilişkileri yakalar. Protokolü uygularken zaman taahhüdü önemli bir husustur.

Temizleme süreci yaklaşık üç hafta sürer ve bu da ileri planlama gerektirir. Hassas 3D morfometrik analizi mümkün kılan bu platform, fibroblast yapısını fonksiyonlarla ilişkilendirerek doku homeostazı ve Z mekanizması hakkında içgörüler kazandırır.