Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Araştırmamız, verim, saflık, canlılık ve işlevsel ömrü optimize etmek için standartlaştırılmış yüksek verimli Lewis Rat gözlük izolasyon protokolü geliştirmeye odaklanmaktadır. Mevcut yöntemler, değişken kirli, kısa ömürlü gözlükler üretmektedir. Bu protokol, sindirim, saflaştırma ve havuzlama standartlaştırarak tutarlılık ve uzun ömürlülüğü artırır.

Başlamak için, ötenazi yapılmış bir fareyi mikroskop altına yerleştirin. Deri makası kullanarak, pubik sentezden başlayarak her yan kaburga kafesine doğru V şeklinde bir kesi yapın ve karın boşluğuna ulaşın. Düz forseps kullanarak, hayvanın sol tarafına ince ve kalın kabartı geri çekilerek karın boşluğu çalışma alanını boşaltın.

Sonra düz forseps ve kavisli hemostatları kullanarak üst onikirikliğini açın. Ortak safra kanalı ve hepatik portal venin görüş alanında olduğundan emin olun. Şimdi kavisli hemostatları kullanarak karaciğeri cephalon yönünde geri çekin.

Ortak safra kanalı ve karaciğer venini karaciğerden bir ila iki milimetre mesafede kelepçe edin. Mikroskop görünümünde, düz forseps ve düz hemostatlarla, onikili çapındaki içeriği nazikçe hareket ettirerek audi sfinkterini temizleyin. Daha sonra onikili koşu yaklaşık beş milimetre boyunca nazikçe sıkıştarak çevre bölgesini izole et.

Doku bütünlüğünü korumak için minimum sıkıştırma sağlanın. Steril WDM içeren bir şırınganın iğnesini dikkatlice onikili çaplı duvardan geçirin. İğneyi sfinkter gövdesinden geçirin ve perfüzyon için ana pankreas kanalına ilerletin.

Sabit basıncı koruyarak, pankreas tamamen şişene kadar yaklaşık saniyede yaklaşık 500 mikrolitre hızla 7 ila 10 mililitre WDM perfüze edin. Şimdi, iki düz hemostatı da onikili kodenumdan çıkarın. Sonra pankreası nazikçe kesip çevredeki yapılardan çıkar; dalak, mide, kalın bağırsak, onikiparı ve mezentardan başlayarak çevresindeki yapılardan ayrılın.

Perfüzyon pankreası düz forsepsle nazikçe kaldırın ve kalan bağ dokusu bağlantılarını kesmek için ince diseksiya makası kullanın. Çıkarılan pankreası hemen buz gibi durulama çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın ve çıkarılan pankreas temizlenirken bir sonraki pankreası toplamaya başlayın. Pankreası temizlemek için, perfüzyona uğramış pankreastan lenf düğümlerini, yağ dokusunu ve büyük damarları dikkatlice çıkarmak için ince kavisli forseps ve ince diseksiyon makası kullanın.

Temizlenmiş pankreası 25 mililitre soğuk WDM içeren steril 600 mililitrelik bir beakere aktarın. Cerrahi çalışma alanından hücre kültürü çalışma alanına transferde temizliği korumak için şişeliği steril alüminyum folyo ile kaplayın. Kabını, 10 dakika boyunca dakikada 130 devirde ayarlanmış yörüngesel bir sarstırıcı su banyosuna aktarın.

Beş dakika geçtiğinde, doku ayrışmasını desteklemek için beşekleri manuel olarak saat yönünde ve sonra saat yönünün tersine çevirin. 10. dakikada, beaker'ı hızla transfer edin ve enzim aktivitesini yavaşlatmak için buza batırın. Sonra sindirimi durdurmak için beakerdeki çözeltiye eşit hacimde söndürme tamponu ekleyin.

14 gauge omurga iğnesi ile donatılmış 50 mililitrelik bir şırınga, büyük doku parçalarını ayırmak için doku süspansiyonunu tekrar tekrar nazikçe aspire edip dışarı atın. Süspansiyonu 200 mililitrelik konik tüplere aktarın. Süspansiyon santrifüjlendikten sonra, süspansiyonu dikkatlice boşaltın ve pelleti 100 mililitrelik yıkama ortamında tekrar süspansiyona yerleştirin.

Şimdi süspansiyonu, steril bir 600 mililitrelik bir beakerin üzerine yerleştirilmiş steril 500 mikrometrelik bir elek üzerinden filtreleyin ve büyük sindirilmemiş dokuyu çıkarın. Filtreyi tekrar santrifüj yapmadan önce yeni 200 mililitrelik konik tüplere aktarın. Gözün arındırması için, her doku peletini iki mililitre pelet hacmi başına 15 mililitre gradyan çözeltisiyle yeniden askıya almak üzere önceden hazırlanmış 10 mililitrelik serolojik pipet kullanın.

Süspansiyon eşit olana kadar nazikçe karıştırın. Her 50 mililitrelik konik tüpün altına dikkatlice 15 mililitre hücre süspansiyonu dağıtın; tüp duvarlarıyla temas kurmadan temiz gradyanlar sağlansın. Sonra, her gradyantan dakikada beş mililitre hızla 10 mililitre dağıtmak için bir şırınga pompası kullanın ve 16 gauge iğne ucunu tüpün iç duvarına yaslayarak karışmayı önleyin.

Tüpler santrifüj edildikten sonra, gradyan katmanları arasındaki arayüzlerde bulunan delik tabakasını belirler. Bir geçmiş pipet kullanarak delik tabakasını toplayın, toplanan gözlükleri beş mililitre yıkama malzemesi içeren önceden soğutulan 200 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Çamaşır ortamı ile hacmi 200 mililitreye çıkarın ve aşağıdaki yıkama ve santrifüj adımlarını gerçekleştirin.

Sonra delikleri doku kültürü olmayan 100 milimetrelik Petri kaplarına eşit şekilde tabaka ile yerleştirin; her beş işlenen pankreas için bir tabak kullanılır. Test izolasyonu boyunca, verim, pankreas başına 3.330 göğüs eşdeğeri ve 50 ila 100 mikrometre aralığında medyan bir gözlük çapı olarak belirlendi. Otomatik boyutlandırma toplamda 98.832 nesne elde etti ve bu, sıfır günde ölçülen manuel göz kapağı eşdeğerleriyle güçlü bir ilişkiye sahipti.

Endokrin saflık, ilk gündeki dithozon boyama ile yaklaşık %98,56 idi. Uyarılma endeksleri birinci günde 9.37, üçüncü günde 8.34 ve yedinci günde 6.7 idi, zaman noktaları arasında anlamlı bir fark yoktu. Bu yöntem, göz nakli, beta hücre fonksiyonu, diyabetin tersine çevrilmesi, göz kapsülasyonu ve göz bebeği bağışıklık veya mikroçevre etkileşimlerinin incelenmesini mümkün kılar.

Bu protokol, preklinik nakil, diyabet modellemesi, kapsülleme çalışmaları ve yüksek saflıkta Lewis Rat gözlükleri gerektiren invitro fonksiyonel testler için uygulanabilir.