Yaşlanmış gözyaşı ve tükürük bezlerinden miyoepitel hücreleri ve fibroblastların tek hücre ayrımı, RNA dizileme ve izolyasyonu protokolü

Laboratuvarım, tükürük ve gözyaşı bezlerindeki yaşa bağlı değişikliklerin akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizileme kullanarak farklı hücre tiplerini nasıl etkilediğini inceliyor. Standart ayrıştırma yöntemleri, yaşlı tükürük ve göz yaşı bezlerinden kırılgan epitel hücrelerini kötü bir şekilde geri kazanır. Ve protokolüm hücre canlılığını artırıyor ve güvenilir tek hücre analizi ile hücre sıralamasını mümkün kılıyor.

Başlamak için, ötenazi edilmiş fareyi diseksiyon masasına sırtüstü konuma getirin. İnce forseps ve makas kullanarak göz ile kulak arasındaki deriyi kesin. Deriyi nazikçe geri çekerek gözyaşı bezini açığa çıkarın.

Kör uçlu forseps kullanarak gözyaşı bezini hafifçe kaldırın. Çevredeki bağ dokusunu dikkatlice ayırdın, nazikçe dairesel bir hareketle uzaklaştırın. Gözyaşı bezinin görünür sınırlarını belirleyin ve onu parotis bezi dahil olmak üzere bitişik dokulardan ayırın.

Sonra lacrimal bezi buz üzerinde iki mililitre soğuk PBS içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Bir disseksiya mikroskobu altında, kalan yağı çıkarın ve bağ dokusu kapsülünü gözlükten dikkatlice çıkarın. Steril 35 milimetrelik Petri kabını buzun üzerine koyun.

Kabın ortasına 800 ila 1000 mikrolitre soğuk PBS ekleyin ve bir lakrimal bezi PBS'ye aktarın. Dokunun PBS'nin altında kaldığından emin olun. İki steril bistüri kullanarak, lakrimal bezi ince ince parçalara indirerek yumuşak bir macun kıvamı elde eder.

Tabakın bir tarafındaki doku parçalarını toplayın. Kalan PBS'yi aspire edin ve parçaları bir mililitre taze soğuk PBS ile yıkayın. Yıkanmış doku parçalarını, önceden ısıtılmış sindirim ortamı başına iki mililitre içeren 12 kuyruklu bir plakaya aktarın.

Tabağı sallanan su banyosuna yerleştirin ve 37 derece Celsius ve dakikada 60 devirde 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Geniş delikli bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, dokuyu 15 kez nazikçe tritüre yapın. Tabağı tekrar sarsıntı su banyosuna koyup 30 dakika daha kuluçka yapın.

Sonrasında, normal bir mililitrelik pipet ucu kullanarak örneği 10 kez nazikçe tritüre edin ve 30 dakika boyunca tekrar kuluçka yapın. Sonra örneği 10 kez nazikçe tritüre ile geçirin ve hücre süspansiyonunu iki mililitrelik yunus mikro santrifüj tüplerine aktarın. Plakanın her bir kuyusuna bir mililitre soğuk bloklama ortamı (BM1) ekleyin; kalan sindirim ortamı toplanır ve tabağı bir sonraki adıma kadar buzun üzerine koyun.

Hücre süspansiyonunu içeren tüpleri 300 G'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Her tüpteki üst malzemeyi atın. Plakanın kalıntı hücrelerini içeren her bir kuyudan BM1'i ilgili tüpe aktarın.

Sonra, her kuyuya 600 mikrolitre soğuk BM1 ekleyerek kalan hücreleri durulayın ve yıkamayı ilgili tüpe aktararak hücre süspansiyonuyla birleştirin. Hücre askısını nazikçe tekrar askıya alın. Tüpleri tekrar 300 G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüj edin ve üst kısımları atınız.

Hücre pelletlerine bir mililitre Accutase ekleyin ve hücreleri nazikçe yeniden süzültün. Tüpü 37 derece Celsius ve dakikada 60 devirde beş ila on dakika boyunca kuluçkaya geçirin. Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, örneği nazikçe 10 kez tritüre yapın.

Daha sonra tüpe bir mililitre soğuk BM2 ekleyerek enzimatik reaksiyonu sonlandırarak Accutase'yi seyreltirin. Tüpü 300 G'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın ve süpernatantı atın. Tüpe mililitrede 200 birim konsantrasyonda DNaz 1 içeren ortam ekleyin; böylece hücreler yeniden süzülür ve tüpü üst kısmına kadar doldurur.

Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın ve beş dakika sonra nazikçe tekrar süzülün. Bu arada, 70 mikrometrelik hücre süzgecini 15 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirin ve süzgeçi bir mililitre BM3 ile önceden ıslatın. İnkubasyondan sonra hücre süspansiyonunu süzgeciye aktarın.

Orijinal toplama tüpüne bir mililitre BM3 ekleyerek durulayın ve durulamayı aynı süzgecin üzerine aktarın. Süzgeci ek olarak beş mililitre BM3 ile yıkayın. Son olarak, tripan mavi boyama ve otomatik hücre sayacı kullanarak filtrelenmiş hücre süspansiyonunun hücre konsantrasyonu ve canlılığını belirleyin.

Gen ifade profili için tek hücreli RNA dizileme veya floresan etiketli hücre popülasyonlarının akış sitometrisine dayalı hücre sıralaması gibi sonraki uygulamalara devam edin. Tek hücreli RNA dizileme verilerinin UMAP analizi, gözyaşı bezinde iyi temsil edilen epitel ve stromal popülasyonları, miyoepitel hücreleri ve fibroblastlar ile çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonlarını tespit etti. Yaşlanmış lacrimal bezlerde bol plazma ve aktive B hücreleri bulunur, IGHM ve IGHD ile.

Ardışık akış sitometrisi kapıtması, EpCAM pozitif, GFP-pozitif miyoepitel hücrelerinin EpCAM negatif, GFP pozitif duvar hücrelerinden net ayrılmasını sağladı. PDGFR alfa ifade eden GFP-pozitif fibroblastlar EpCAM negatifti, bu da epitel hücrelerinden ayırt edilemesine olanak tanıyordu. PDGFR alfa, EGFP farelerinde, tüm GFP pozitif hücreler ayrıca kollajen bir olarak ifade edilir ve fibroblast kimliğini doğrular.

Akış sitometrisi analizi, GFP pozitif hücrelerin %99,6'sının PDGFR alfa immünbone hücrelerine karşılık geldiğini gösterdi. Bu protokol, epitel, stromal ve bağışıklık popülasyonlarının moleküler karakterizasyonu için lakrimal bezlerden canlı tek hücreleri izole etmek amacıyla tasarlanmıştır. Ana zorluk, kırılgan yaşlanmış dokunun ayrışması sırasında mekanik ve enzimatik stresi en aza indirmek ve aynı zamanda tek hücreli RNA dizileme için yüksek hücre canlılığını korumaktır.

Bu prosedüre göre, izole hücreler tek hücreli RNA dizileme, toplu RNA dizileme ve belirli hücre popülasyonlarının moleküler profillenmesi için kullanılabilir. Sıralanmış hücreler ayrıca sonraki fonksiyonel testler için kültürlenebilir.