Hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinde oksijen dağıtımı uygulamaları için sentez, hemoglobin kapsülasyonu ve biortogonal PEGilasyon
8 Mayıs 2026
Bu protokol, oksijen teslimatı için tasarlanmış hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinin sentezini, hemoglobin kapsüllenmesini ve yüzey PEGilasyonunu detaylandırır. Bu yöntem, kusur mühendisliğini zorlanma destekli biortogonal konjugasyon ile birleştirerek biyomedikal uygulamalara uygun yüksek geçirgenlikli ve fizyolojik olarak stabil taşıyıcılar üretir.
Bu araştırmanın amacı, hemoglobin kapsülasyonu ve oksijen teslimatı için kararlı bir metal-organik çerçeve, MOF tabanlı nanopartikül tanımlamaktır. Hiyerarşlı gözenekli morf, hemoglobin kapsülasyonu için post boyut sınırlamasını aşabilir ve yüzey popülasyonu fizyolojik ortamlarda parçacık kararlılığını artırabilir. Başlamak için, hazırlanmış hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66'yı 50 miligram hassas şekilde tartarak nanopartikülleri 25 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeye aminleyin.
Şişeye 10 mililitre tetrahidrofuran ekleyin. Sonra karışımı beş dakika ultra sonikle geçirerek parçacıkların tamamen dağıtılması sağlanır ve eşit opak bir süspansiyon elde edilir. Yuvarlak tabanlı şişeyi 400 RPM'ye ayarlanmış manyetik karıştırıcı üzerinde buzlu su banyosuna yerleştirin.
Cam şırınga kullanarak, beş dakika boyunca damla 0,4 mililitre tert butil nitrit ekleyin ve sıcaklığı beş derece Celsius'un altında tutun. Aynı soğuk koşullarda hemen 0,35 mililitre trimetil SL azidi damla olarak ekleyin. Hafif bir kabarcık oluşabilir ve bu nitrozasyon ilerlemesini gösterebilir.
Sonra buzlu su banyosunu ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın. Reaksiyon karışımını buzlu su banyosunda gece boyunca karıştırmaya devam edin. Ertesi gün, ürünü gösterildiği gibi yıkayıp kurutun.
Sonra kimyasal dönüşümü doğrulamak için FTIR spektroskopisi kullanın. Beş miligram hiyerarşik gözenekli UIO 66 azid nanopartiküllerini iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. 0,5 mililitre HEPES tamponu ekleyin ve iki ila beş dakika sonikasyon yapın.
20 miligram/mililitre hemoglobin içeren 0,5 mililitre HEPES tamponu ekleyin ve nanopartikülleri tamamen dağıtmak için tüpü birkaç kez nazikçe ters çevirin. Şimdi tüpü termo çalkalayıcıya koyup oda sıcaklığında 1.000 RPM'de iki saat boyunca çalkalayarak kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra, tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 13.500 G'de santrifüjlenerek hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 azid nanopartiküllerini pellet edilir.
Sonra süpernatantı dikkatlice toplayarak hapsedilmemiş hemoglobinin niceliğini ölçerin. Pelleti bir mililitre ultrasaf suyla nazikçe üç kez yuplayın; pipetle yukarı aşağı ve gevşek emilmiş hemoglobini çıkarın. Sonra her yıkamanın süpernatanını dikkatlice toplayarak hapsolmuş hemoglobinin miktarını ölçerin.
Son peleti 0,5 mililitre ultra saf suya yeniden süsleyip karakterizasyondan önce buzdolabında saklayın. Toplanan süpernatantlarda hapsolmuş hemoglobini belirlemek için sodyum defne sülfat hemoglobin testini kullanın. Her üst panelden 10 mikrolitre pipetle 96 delikli mikroplakaya alın.
100 mikrolitre sodyum defne sülfat reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta beş dakika kuluçka yapın. Ultraviyole görünür spektrofotometre kullanarak, 412 nanometrede absorbansı ölçün. Daha sonra, HEPES tamponunda hemoglobin stokunun seri seyreltmesini hazırlayarak standart bir eğri oluşturulur.
Hazırlanan seyreltmeleri hazırlanmış 96 kuyu plakaya aktararak absorbans okumalarını hemoglobin konsantrasyonlarına dönüştürmek için standart bir eğri oluşturulur. Hiyerarşik olarak gözenekli olan hemoglobinin 10 miligramını, UIO 66 azid nanopartiküllerini, 0,5 mililitre ultrasaf su içeren iki mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve iki ila beş dakika boyunca sonikat yapın. Polietilen glikol ile değiştirilerek polietilen glikol ile birlikte 20 miligram dibenzosiklooktan ekleyin; böylece polietilen glikol ile nanopartiküllerin eşit bir oranı elde edilir.
Karışım homojenleşene kadar tüpü nazikçe vortex yapın. Tüpü termo sallayıcıya koyun ve oda sıcaklığında, 1.000 RPM'de bir saat boyunca sallayarak kuluçka yapın. Sonra tüpü dört derece Celsius sıcaklığında tutulan bir buzdolabına aktararak gece boyunca reaksiyon veriyor.
Tüpü oda sıcaklığında 12.000 G'de beş dakika boyunca santrifüjlenerek polietilen glikol modifiyeli, hemoglobin yüklenmiş, hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 nanopartiküllerini pelet et. Sonra, reaktif olmayan polietilen glikol içeren süpernatantı atabilirsiniz. Peleti iki mililitre ultrasaf suyla üç kez yıkayarak yukarı aşağı pipet ve santrifüj yaparak daha önce gösterilen koşullarda santrifüj yapın.
Arıtılmış pegile hemoglobin yüklü, hiyerarşik olarak gözenekli, UIO 66 polietilen glikol nanopartiküllerini iki mililitre ultra saf suya yeniden askıya alın. Süspansiyonu dört derece Celsius'ta sakla. Ortaya çıkan kolloid homojen ve hafif opalesans görünür, bu da iyi bir dispersyon stabilitesini gösterir.
Daha sonra dinamik ışık saçılması (DLS) ile başarılı pesilasyonu doğrulayın. Yüzey amino grupları başarıyla azidlere dönüştürüldü. Bu, hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 azid nanopartiküllerinin FTIR spektrumunda 2.122 ters santimetre olan karakteristik asimetrik azid, uzanma bandının ortaya çıkmasıyla gösterilmiştir.
Bu bant, hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 amin nanopartiküllerinde yoktu. Hemoglobin kapsülasyonu, belirgin sarıdan kırmızıya renk değişimiyle görsel olarak gösterildi. Hemoglobin yüklendikten sonra azot alımı azalmış, bu da mezoporların hemoglobin molekülleri tarafından işgal edildiğini gösterir.
Hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 azid nanopartiküllerinin zeta potansiyeli, hemoglobin kapsüllenmesinden sonra 42,9 milivolttan 20,4 milivolt'a düştü. Başarılı polietilen glikol konjugasyonu, azidlerin 2.122 ters santimetre geride titreşiminin kaybolması ve FTIR spektrumunda polietilen glikol ilişkili sinyallerin ortaya çıkmasıyla doğrulandı. DLS analizi, pegilasyondan sonra hidrodinamik çapın yaklaşık 114,9'dan 140,8 nanometreye yükseldiğini ve düşük PDI korunduğunu gösterdi.
Bu parçacık, hiyerarşik olarak gözenekli morf nanopartiküllerinin sentezini, hemoglobin kapsülasyonunu, yüzey pekülasyonunu ve oksijen salınım fonksiyonelliğinin değerlendirilmesini sağlar. Bu protokol kullanılarak, in vitro oksijen salınımı ve nanopartikül biyouyumluluk analizi dahil olmak üzere ek fiziksel kimyasal karakterizasyon ve fonksiyonel çalışma yapılabilir. Gelecekteki çalışmalar, bileşenlerin madde bozunmasını önlemek gibi nedenlerle hemoglobin işlevselliğini daha uzun süreli korumaya odaklanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Overview
This article presents a detailed, scalable protocol for fabricating hierarchically porous UiO-66 nanoparticles (HP-UiO-66 NPs) designed to encapsulate hemoglobin (Hb) for use as hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs). The protocol emphasizes reproducibility, scalability, and stability, utilizing bioorthogonal polyethylene glycol (PEG) shells to enhance nanoparticle performance and biocompatibility. The workflow is modular and adaptable for encapsulating other biomacromolecules or enzymes for therapeutic delivery.
Key Study Components
Area of Science
- Nanomaterials
- Biomaterials
- Oxygen delivery systems
- Biomedical engineering
Background
- Hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs) are developed to address hypoxia in biomedical applications.
- Free hemoglobin is unstable and vasoactive outside red blood cells, limiting its direct use.
- Metal-organic frameworks (MOFs), such as UiO-66, offer tunable porosity and stability for encapsulation.
- PEGylation is commonly used to improve nanoparticle stability and biocompatibility.
Purpose of Study
- To provide a reproducible, step-by-step protocol for fabricating HP-UiO-66 NPs encapsulating Hb.
- To enhance the stability and oxygen-carrying capacity of encapsulated Hb using PEG shells.
- To detail troubleshooting strategies and critical parameters for inter-laboratory reproducibility.
Methods Used
- Defect engineering of UiO-66-NH2 nanoparticles via dodecanoic acid modulation and acid washing.
- Surface amine conversion to azides for subsequent bioorthogonal chemistry.
- Encapsulation of hemoglobin in buffered aqueous media.
- PEGylation using catalyst-free strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC).
- Comprehensive physicochemical characterization (crystallinity, porosity, surface chemistry, PEG corona).
- Functional assays for oxygenation/deoxygenation of encapsulated Hb.
Main Results
- Gram-scale production of HP-UiO-66-NH2 NPs per batch is achievable.
- Encapsulation efficiencies of ~35% (loading content ~24 wt%) for Hb under mild conditions.
- PEGylated NPs exhibit a hydrodynamic diameter of ~140 nm and low polydispersity.
- Physicochemical analyses confirm framework integrity, mesoporosity, and successful PEGylation.
- Encapsulated Hb retains reversible oxygenation/deoxygenation capacity.
- PEGylation significantly improves colloidal and structural stability in various biological media.
Conclusions
- The protocol enables robust, scalable fabrication of MOF-based HBOCs with high encapsulation efficiency and stability.
- PEGylation is critical for maintaining nanoparticle integrity and function in physiological environments.
- The workflow is modular and adaptable for other therapeutic biomacromolecules or enzymes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Hierarchically porous UiO-66 nanoparticles encapsulating hemoglobin and stabilized by bioorthogonal PEGylation address critical challenges in oxygen delivery system development. This modular, scalable protocol enhances predictive confidence in nanoparticle-based therapeutic carriers by ensuring reproducibility, stability, and functional oxygen transport. The approach supports robust pipeline integration for advanced biomacromolecule delivery platforms in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic evaluation of nanoparticle encapsulation and stabilization strategies for therapeutic protein delivery.
- Supports mechanistic de-risking by verifying hemoglobin functionality post-encapsulation and PEGylation.
- Facilitates target validation for oxygen carrier systems through quantitative oxygenation/deoxygenation assays.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible nanoparticle preparations for downstream screening of oxygen delivery efficacy.
- Delivers quantitative encapsulation efficiency and physicochemical characterization outputs for assay benchmarking.
- Enables scalable production of uniform nanoparticles, supporting high-throughput screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Demonstrates stability and functional retention of encapsulated hemoglobin in physiologically relevant media.
- Aligns with translational biomarker requirements by confirming reversible oxygen transport in vitro.
- Supports risk-adjusted advancement of nanoparticle-based HBOCs toward preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions HP-UiO-66-PEG nanoparticles as a bridge from early discovery through preclinical model development for oxygen carrier therapeutics.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing for protein encapsulation and stabilization in MOF-based carriers.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for nanoparticle characterization and functional assays.
- Analytics: Supplies encapsulation efficiency, hydrodynamic size, and oxygenation data for comparative analysis.
- Translational Research: Demonstrates nanoparticle stability and function in serum and physiological buffers.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to other therapeutic biomacromolecules or enzymes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nanoparticle-based oxygen carriers and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes nanoparticle synthesis and PEGylation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for therapeutic carrier platforms and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of advanced delivery systems for hypoxia mitigation and beyond.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle synthesis, surface chemistry, and protein encapsulation.
- Needs access to analytical instrumentation for physicochemical and functional characterization.
- Demands cross-team standardization of critical parameters and troubleshooting protocols.
- Adaptable to various biomacromolecules with consideration for protein stability and compatibility.
- Scale-up and reproducibility depend on precise control of defect engineering and PEGylation steps.
