Hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinde oksijen dağıtımı uygulamaları için sentez, hemoglobin kapsülasyonu ve biortogonal PEGilasyon

Bu araştırmanın amacı, hemoglobin kapsülasyonu ve oksijen teslimatı için kararlı bir metal-organik çerçeve, MOF tabanlı nanopartikül tanımlamaktır. Hiyerarşlı gözenekli morf, hemoglobin kapsülasyonu için post boyut sınırlamasını aşabilir ve yüzey popülasyonu fizyolojik ortamlarda parçacık kararlılığını artırabilir. Başlamak için, hazırlanmış hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66'yı 50 miligram hassas şekilde tartarak nanopartikülleri 25 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeye aminleyin.

Şişeye 10 mililitre tetrahidrofuran ekleyin. Sonra karışımı beş dakika ultra sonikle geçirerek parçacıkların tamamen dağıtılması sağlanır ve eşit opak bir süspansiyon elde edilir. Yuvarlak tabanlı şişeyi 400 RPM'ye ayarlanmış manyetik karıştırıcı üzerinde buzlu su banyosuna yerleştirin.

Cam şırınga kullanarak, beş dakika boyunca damla 0,4 mililitre tert butil nitrit ekleyin ve sıcaklığı beş derece Celsius'un altında tutun. Aynı soğuk koşullarda hemen 0,35 mililitre trimetil SL azidi damla olarak ekleyin. Hafif bir kabarcık oluşabilir ve bu nitrozasyon ilerlemesini gösterebilir.

Sonra buzlu su banyosunu ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın. Reaksiyon karışımını buzlu su banyosunda gece boyunca karıştırmaya devam edin. Ertesi gün, ürünü gösterildiği gibi yıkayıp kurutun.

Sonra kimyasal dönüşümü doğrulamak için FTIR spektroskopisi kullanın. Beş miligram hiyerarşik gözenekli UIO 66 azid nanopartiküllerini iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. 0,5 mililitre HEPES tamponu ekleyin ve iki ila beş dakika sonikasyon yapın.

20 miligram/mililitre hemoglobin içeren 0,5 mililitre HEPES tamponu ekleyin ve nanopartikülleri tamamen dağıtmak için tüpü birkaç kez nazikçe ters çevirin. Şimdi tüpü termo çalkalayıcıya koyup oda sıcaklığında 1.000 RPM'de iki saat boyunca çalkalayarak kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra, tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 13.500 G'de santrifüjlenerek hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 azid nanopartiküllerini pellet edilir.

Sonra süpernatantı dikkatlice toplayarak hapsedilmemiş hemoglobinin niceliğini ölçerin. Pelleti bir mililitre ultrasaf suyla nazikçe üç kez yuplayın; pipetle yukarı aşağı ve gevşek emilmiş hemoglobini çıkarın. Sonra her yıkamanın süpernatanını dikkatlice toplayarak hapsolmuş hemoglobinin miktarını ölçerin.

Son peleti 0,5 mililitre ultra saf suya yeniden süsleyip karakterizasyondan önce buzdolabında saklayın. Toplanan süpernatantlarda hapsolmuş hemoglobini belirlemek için sodyum defne sülfat hemoglobin testini kullanın. Her üst panelden 10 mikrolitre pipetle 96 delikli mikroplakaya alın.

100 mikrolitre sodyum defne sülfat reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta beş dakika kuluçka yapın. Ultraviyole görünür spektrofotometre kullanarak, 412 nanometrede absorbansı ölçün. Daha sonra, HEPES tamponunda hemoglobin stokunun seri seyreltmesini hazırlayarak standart bir eğri oluşturulur.

Hazırlanan seyreltmeleri hazırlanmış 96 kuyu plakaya aktararak absorbans okumalarını hemoglobin konsantrasyonlarına dönüştürmek için standart bir eğri oluşturulur. Hiyerarşik olarak gözenekli olan hemoglobinin 10 miligramını, UIO 66 azid nanopartiküllerini, 0,5 mililitre ultrasaf su içeren iki mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve iki ila beş dakika boyunca sonikat yapın. Polietilen glikol ile değiştirilerek polietilen glikol ile birlikte 20 miligram dibenzosiklooktan ekleyin; böylece polietilen glikol ile nanopartiküllerin eşit bir oranı elde edilir.

Karışım homojenleşene kadar tüpü nazikçe vortex yapın. Tüpü termo sallayıcıya koyun ve oda sıcaklığında, 1.000 RPM'de bir saat boyunca sallayarak kuluçka yapın. Sonra tüpü dört derece Celsius sıcaklığında tutulan bir buzdolabına aktararak gece boyunca reaksiyon veriyor.

Tüpü oda sıcaklığında 12.000 G'de beş dakika boyunca santrifüjlenerek polietilen glikol modifiyeli, hemoglobin yüklenmiş, hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 nanopartiküllerini pelet et. Sonra, reaktif olmayan polietilen glikol içeren süpernatantı atabilirsiniz. Peleti iki mililitre ultrasaf suyla üç kez yıkayarak yukarı aşağı pipet ve santrifüj yaparak daha önce gösterilen koşullarda santrifüj yapın.

Arıtılmış pegile hemoglobin yüklü, hiyerarşik olarak gözenekli, UIO 66 polietilen glikol nanopartiküllerini iki mililitre ultra saf suya yeniden askıya alın. Süspansiyonu dört derece Celsius'ta sakla. Ortaya çıkan kolloid homojen ve hafif opalesans görünür, bu da iyi bir dispersyon stabilitesini gösterir.

Daha sonra dinamik ışık saçılması (DLS) ile başarılı pesilasyonu doğrulayın. Yüzey amino grupları başarıyla azidlere dönüştürüldü. Bu, hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 azid nanopartiküllerinin FTIR spektrumunda 2.122 ters santimetre olan karakteristik asimetrik azid, uzanma bandının ortaya çıkmasıyla gösterilmiştir.

Bu bant, hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 amin nanopartiküllerinde yoktu. Hemoglobin kapsülasyonu, belirgin sarıdan kırmızıya renk değişimiyle görsel olarak gösterildi. Hemoglobin yüklendikten sonra azot alımı azalmış, bu da mezoporların hemoglobin molekülleri tarafından işgal edildiğini gösterir.

Hiyerarşik olarak gözenekli UIO 66 azid nanopartiküllerinin zeta potansiyeli, hemoglobin kapsüllenmesinden sonra 42,9 milivolttan 20,4 milivolt'a düştü. Başarılı polietilen glikol konjugasyonu, azidlerin 2.122 ters santimetre geride titreşiminin kaybolması ve FTIR spektrumunda polietilen glikol ilişkili sinyallerin ortaya çıkmasıyla doğrulandı. DLS analizi, pegilasyondan sonra hidrodinamik çapın yaklaşık 114,9'dan 140,8 nanometreye yükseldiğini ve düşük PDI korunduğunu gösterdi.

Bu parçacık, hiyerarşik olarak gözenekli morf nanopartiküllerinin sentezini, hemoglobin kapsülasyonunu, yüzey pekülasyonunu ve oksijen salınım fonksiyonelliğinin değerlendirilmesini sağlar. Bu protokol kullanılarak, in vitro oksijen salınımı ve nanopartikül biyouyumluluk analizi dahil olmak üzere ek fiziksel kimyasal karakterizasyon ve fonksiyonel çalışma yapılabilir. Gelecekteki çalışmalar, bileşenlerin madde bozunmasını önlemek gibi nedenlerle hemoglobin işlevselliğini daha uzun süreli korumaya odaklanabilir.