Name: AAV Transdüksiyon Çalışmaları için 3B Sferoidlerin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Öğrenin, AAV transdüksiyon etkinliğini ve transgen ekspresyon kinetiğini değerlendirmek için 3B sferoid platformunu nasıl kullanacağınızı. Bu yöntem, gen tedavisi vektör optimizasyonu için sağlam, nicel ve gerçek zamanlı bir değerlendirme sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, AAV nanolüsiferaz üretimi için plazmidi ve canlı substrat reaktiflerini sağladıkları için Morten Seirup ve Trish Hoang'a teşekkür ederler. Bu proje, ABD Enerji Bakanlığı ile FDA arasındaki kurumlar arası bir anlaşma kapsamında Oak Ridge Bilim ve Eğitim Enstitüsü tarafından yürütülen, ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) CBER bünyesindeki ORISE Araştırma Katılım Programı'na yapılan bir atama ile desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.</li>
	<li>Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.</li>
	<li>Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.</li>
	<li>Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.</li>
	<li>Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.</li>
	<li>Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/.</li>
	<li>Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products.</li>
	<li>Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.</li>
	<li>Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.</li>
	<li>Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.</li>
	<li>Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.</li>
	<li>Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.</li>
	<li>Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.</li>
	<li>Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.</li>
	<li>Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.</li>
	<li>Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.</li>
	<li>Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.</li>
	<li>McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.</li>
	<li>Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.</li>
	<li>Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.</li>
	<li>Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.</li>
	<li>El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.</li>
	<li>Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.</li>
	<li>Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.</li>
	<li>Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.</li>
	<li>Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.</li>
	<li>Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.</li>
	<li>Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.</li>
</ol>

Yazarların beyan edeceği herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada, AAV geliştirme ve potans testi için optimize edilmiş bir in vitro&#160;3B platformu sunuyoruz. Bu platform, insan doku mimarisini daha yakından taklit eden üç boyutlu hücre kültürü kullanarak artırılmış transdüksiyon, yüksek hassasiyet ve daha iyi translasyonel öngörülebilirlik sağlar. Bu sistem; tek zincirli ve kendini tamamlayan vektörler dahil olmak üzere, birden fazla hücre hattında farklı AAV serotipleri ve düzenleyici elementler arasındaki transdüksiyon etkinliğini başarıyla ayırt eder. Transdüksiyon verimliliğinin genellikle transgen-pozitif hücrelerin yüzdesi olarak tanımlandığı geleneksel 2B analizlerin aksine, 3B sferoid sisteminin tek hücre çözünürlüğünde kantifikasyona kolaylıkla izin vermediğini belirtmek isteriz. Bu nedenle, bu çalışmada transdüksiyon verimliliği, transdükte edilen hücrelerin oranı ile hücre başına transgen ekspresyon düzeyinin birleşik katkılarını yansıtan toplu raporlayıcı sinyal yoğunluğu (floresan veya lüminesans) olarak tanımlanmıştır. Sferoidlerin yüksek hassasiyeti, yüksek ürün miktarlarına olan ihtiyacı önemli ölçüde azaltarak sistemi AAV araştırma ve geliştirme çalışmaları için maliyet etkin, çok yönlü ve fizyolojik olarak uygun hale getirmektedir.
Bu yaklaşım, yapay yüzeylere yapışmaya dayanan ve hücresel organizasyondan yoksun olan geleneksel 2D hücre kültürü analizlerindeki temel zorlukları ele almaktadır; bu durum muhtemelen&#160;bu durum, klinik ortamlardaki vektör performansının zayıf tahmin edilmesine yol açmaktadır. 3D sferoid sistemi, doku yapısını ve ilaç dağılım modellerini daha iyi taklit ederek gerçek biyolojik koşullarla daha yakından eşleşen vektör davranış verileri sağlamaktadır.22,23Protokol, basit ultra düşük yapışma özellikli plakalar kullandığından, standart laboratuvar ortamlarında kolayca tekrarlanabilmektedir.
Bu uyarlanabilir sistem, AAV nötralizasyon analizleri için, AAV penetrasyonunu incelemek amacıyla ve farklı hücresel ortamların AAV transdüksiyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için daha karmaşık ko-kültür deneyleri geliştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, yüksek verimli ilaç ve vektör tarama platformları sferoid platformuyla kolayca entegre edilebilir; bu da daha hedefli ürünlerin geliştirilmesine yönelik vektör keşif iş akışlarında otomasyonu ve maliyet düşüşünü sağlar.
Sferoidlerin temel bir pratik avantajı, hücre pasajlaması gerektirmeden haftalarca sürekli büyüyebilmeleri ve böylece AAV aktivitesinin kapsamlı çalışmalarına olanak tanımalarıdır. Bu stabil kültür sistemi, 2D kültürlerde gerekli olan tekrarlayan hücre hasadının neden olduğu kesintileri önleyerek, önemli hücre-hücre etkileşimlerini ve matris bileşenlerini korur24. Korunan hücresel ortam, AAV'nin hücrelere bağlanmasını ve girişini değerlendirmek için temel olan doğal protein organizasyonunu ve membran yapılarını destekler25.
3B sferoidler, AAV transduksiyon değerlendirmeleri için büyük bir potansiyel göstermelerine rağmen, temel olarak yerli dokulara kıyasla basitleştirilmiş yapıları nedeniyle in vivo&#160;modellerle karşılaştırıldığında bazı translasyonel eksiklikler de sunarlar. Sferoidler; vektör iletimi için vaskülarizasyon, immünojeniteyi değerlendirmek için immün hücreler ve kan-beyin bariyeri gibi AAV performansını önemli ölçüde etkileyebilecek dokuya özgü bariyerler dahil olmak üzere kritik fizyolojik bileşenlerden yoksundur26. Bu kısıtlamalar, sferoidlerin geleneksel 2B kültürler ile in vivo hayvan modelleri arasında orta düzeyde bir karmaşıklık sunmasına rağmen, kapsamlı AAV değerlendirmesi için gereken fizyolojik mikroçevreyi tam olarak yeniden oluşturmak için yetersiz kaldığını göstermektedir.
Burada sunulan sferoid protokolü, her seferinde tek bir hücre tipini tanımlamaktadır. Bu protokol, temel bir üç boyutlu yapı oluşturacak şekilde kümelenen 2–3 ek hücre tipini içerecek şekilde geliştirilebilir. Organoidler veya mikroakışkanlar gibi daha karmaşık 3D modeller, doku benzeri paternlerde düzenlenmiş 10 veya daha fazla farklı hücre tipi içeren ve belirli organların hücresel çeşitliliğini ve organizasyonunu yeniden oluşturan çok hücreli sistemlerdir. Bu tür gelişmiş 3D organoidler; çoklu hücreleri27, hidrojel gömülü kültürleri, asılı damla tekniklerini ve mikroakışkan platformları11,27,28 içerebilir. Bu yöntemler, AAV biyolojisine dair anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olabilecek daha karmaşık doku mimarileri sağlasa da, genellikle daha özel reaktifler, ekipmanlar ve önemli ölçüde teknik uzmanlık gerektirme eğilimindedirler. Öte yandan, ultra düşük yapışmalı plaklarda oluşturulan 3D sferoidler çok daha basittir ve maliyet etkinliği ile tekrarlanabilirliği sayesinde birçok laboratuvar için uygundur.
Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için kritik adımlar arasında, hücre canlılığının yüksek tutulması yer alır; çünkü hasarlı hücreler sferoid oluşumunu ve transduksiyon verimliliğini olumsuz etkileyebilir. Sferoid kompaktlığının sağlanması için ultra düşük yapışma özellikli plakaların kullanımı ve santrifüjleme işleminin optimizasyonu da kritiktir. Zayıf sinyallerden veya doygunluktan kaçınmak için her hücre tipi ve AAV serotipi için MOI'nin optimize edilmesi esastır. Uygun tespit yönteminin seçimi, özellikle sürekli canlı hücre görüntüleme sistemleriyle uyumluluğun gerektiği kinetik analizler için kritik önem taşır. 3D sferoidlerde AAV transduksiyonunun doğru yorumlanması için çeşitli teknik hususlar önemlidir.
Yetersiz veya mevcut olmayan bir transdüksiyon sinyali; düşük viral titreden, suboptimal MOI değerinden veya yetersiz inkübasyon süresinden kaynaklanabilir; bu durum, viral titrelerin doğrulanması, MOI'nin optimize edilmesi ve inkübasyon süresinin (genellikle 3–5 gün) uzatılmasıyla giderilebilir. Zayıf floresans veya lüminesans sinyalleri, düşük transgen ekspresyonunu veya 3D yapı içinde sınırlı reaktif penetrasyonunu yansıtabilir; bu durum, pozlama ayarlarının optimize edilmesi veya substrat difüzyonu için ek süre tanınmasıyla iyileştirilebilir. HeLa hücreleri gibi belirli hücre hatlarındaki temel zorluklardan biri, yüksek arka plan sinyaline ve floresans tabanlı analizlerde azalmış hassasiyete yol açabilen otofloresanstır. Bu sınırlamayı gidermek için, daha iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlayan ve otofloresan arka planlarda transdüksiyonun daha doğru tespit edilmesine olanak tanıyan lüminesans tabanlı bir nanolüsiferaz raporlayıcı sistem uyguladık. Ek olarak, arka plan sinyali uygun olmayan eşikleme veya medya kaynaklı floresanstan kaynaklanabilir ve temel seviyeleri belirlemek için işlem görmemiş kuyucuklar (MOI = 0) kullanılarak kontrol edilmelidir. Son olarak, yüksek MOI değerlerinde sinyal saturasyonu, aşırı viral girdiye veya detektör sınırlamalarına bağlı olarak meydana gelebilir; bu durum, MOI aralığının düşürülmesi ve ölçümlerin lineer dinamik aralıkta tutulması için detektör pozlama ayarlarının optimize edilmesiyle hafifletilebilir.
Genel olarak, bu 3D sferoid metodolojisi, AAV transdüksiyonunu, potansiyelini ve kinetiğini değerlendirmek için modernize edilmiş, tekrarlanabilir bir sistem sunar. Konvansiyonel 2D analizler ile in vivo çalışmalar arasındaki boşluğu doldurarak, daha bilinçli vektör geliştirilmesine olanak tanır ve klinik olarak ilgili gen tedavisi stratejilerinin ilerlemesini destekler.

AAV vektörleri, güvenlik profilleri ve kalıcı gen ekspresyonu sağlama yetenekleri nedeniyle in vivo uygulamalar için tercih edilen gen iletim sistemlerinden biri haline gelmiştir1. AAV gen tedavisi, geliştirme aşamasındaki yüzlerce ürünle birlikte, birçok nadir hastalık endikasyonunun tedavisinde başarı göstermektedir2. Ayrıca, gelişmekte olan uygulamalar arasında, tedavisi zor endikasyonların iyileştirilmesine yardımcı olma potansiyeli yüksek olan Cas9 gibi genom düzenleme bileşenlerinin in vivo iletimi yer almaktadır3. Temel geliştirme zorlukları arasında yüksek üretim maliyetleri ve mevcut in vitro analizlerin ürün kalitesini ve klinik etkinliği belirlemedeki sınırlı öngörü kapasitesi bulunmaktadır4.
AAV terapötiklerinin ilerlemesi, klinik performansı doğru bir şekilde öngörebilen prediktif ve standartlaştırılmış aktivite analizlerinin eksikliği nedeniyle temel olarak sınırlanmıştır4,5. Bu analizler; mühendislik ürünü vektör kütüphanelerinin taranması, hedeflemeyi artırmak için kapsid modifikasyonlarının optimize edilmesi ve dokuya özgü tropizmin değerlendirilmesi dahil olmak üzere birçok amaçla kullanıldıkları için geliştirme sürecinin kritik bir bileşenidir. Ayrıca, regülatör sekansların transgen ekspresyonu üzerindeki etkisini karakterize etmeye de hizmet ederler6. Aday seçimi dışında, AAV transduksiyon analizleri; lot salımı, lot karşılaştırma çalışmaları ve stabilite değerlendirmeleri için kullanılan potens analizleri aracılığıyla kritik üretim kalite kontrolünü de destekler6,7.
Bilimsel zorluk, rutin kullanım için pratik uygulanabilirliği korurken vektör-konak etkileşimlerinin karmaşıklığını yakalayan analizler geliştirmektir7,8. Mevcut yaklaşımlar, geleneksel 2D monokatman kültürlerinde hedef organı temsil eden ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının kullanımını içermektedir. Bu kültür koşulları fizyolojik uygunluktan yoksundur ve yüksek ilaç dozları gerektirir. Bu durum, laboratuvar tahminleri ile klinik çevrilebilirlik arasında önemli bir boşluk yaratmaktadır. AAVR aşırı eksprese eden veya CRISPR ile aktive edilen sistemler gibi yeni mühendislik ürünü hücre hatları önemli ilerlemeleri temsil etse de, doğal dokulara özgü üç boyutlu mimariyi ve hücre dışı matriks etkileşimlerini yeniden oluşturmakta yetersiz kalmaktadır9,10,11. in vivo mikroortamları daha iyi simüle eden yeni nesil modeller, bu translasyonel kopukluğu giderebilir12,13,14.
AAV transduksiyon deneylerinin translasyonel değerini artırmak amacıyla, yakın zamanda AAV transduksiyonu için optimize edilmiş 3D bir sferoid sistem geliştirdik. Bu sistem, altın standart olan 2D deneylerle karşılaştırıldığında, birden fazla hücre hattında ve AAV serotiplerinde AAV transduksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırmaktadır. Artan hassasiyetin ve deneyde kullanılan ürünün korunmasının yanı sıra bu modeller, sferoid içindeki hücresel konuma göre değişen gerçekçi hücre-hücre etkileşimleri sağlayarak 2D monokatmanlara göre iyileştirme sunar. Ayrıca, gerçek organ koşullarını simüle eden ilaç penetrasyonunun anlamlı bir şekilde incelenmesine olanak tanır11,15,16. Dahası, bu sferoid yaklaşımı, standart laboratuvar ekipmanları kullanması ve özel besiyeri veya iskele gereksinimlerini ortadan kaldırması nedeniyle, daha karmaşık organoid veya ko-kültür sistemlerine göre pratik avantajlar sağlar. Bu basitlik, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği garanti ederek sistemi rutin gen tedavisi testleri ve vektör geliştirme iş akışları için uygun hale getirir17.
Bu 3D sferoid platformu, özellikle düşük dozlarda AAV transduksiyonunun hassas tespitini ve vektör genom tasarımlarının karşılaştırmalı değerlendirmesini gerektiren uygulamalar için oldukça uygundur. Ayrıca serotipe bağlı tropizmin değerlendirilmesini de destekler. Geleneksel 2D kültürlerde yüksek AAV dozları gerektiren, nispeten düşük transduksiyon verimliliğine sahip hücre hatları için özellikle avantajlıdır. Bu bağlamlarda, 3D platformunun artırılmış hassasiyeti ve gelişmiş fizyolojik uygunluğu kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, bu sistem; immün bileşenler, vasküler iletim veya tam doku kompleksliği gerektiren çalışmalar için daha az uygun olabilir. Bunun nedeni, sferoidlerin in vivo&#160;ortamı tamamen yeniden oluşturamamasıdır.
Böylece, iki kritik ve tamamlayıcı okuma parametresine sahip, AAV transduksiyon analizleri için optimize edilmiş basit bir 3B sferoid protokolü sunuyoruz: transduksiyon verimliliği (burada sferoid başına toplam raporlayıcı sinyal olarak tanımlanmıştır) ve transduksiyon kinetiği. Bu yöntem; AAV potens değerlendirmesi, vektör tasarımı ve nötralizasyon analizleri için maliyet etkin, fizyolojik olarak ilgili ve bilgilendirici bir platform sağlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>37°C inkübatör</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>Standart kültür koşulları</td></tr><tr><td>A375 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>AAV1 plazmidi</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>AAV plazmidi</td></tr><tr><td>AAV2 plazmidi</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>AAV plazmidi</td></tr><tr><td>AAV5 plazmidi</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>AAV plazmidi</td></tr><tr><td>AAV8 plazmidi</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>AAV plazmidi</td></tr><tr><td>AAV9 plazmidi</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>AAV plazmidi</td></tr><tr><td>BioTek GEN5 plaka okuyucu</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>Floresans veya lüminesans için uç nokta okuması</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>Sferoid süspansiyonunu korumak için</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; Hücre Kültürü Fosfat Tamponlu Salin (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>Hücreleri durulamak için PBS</td></tr><tr><td>DMEM yüksek glukoz, GlutaMAX takviyesi, piruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>Tam büyüme besiyeri</td></tr><tr><td>Ekstraselüler NanoLuc İnhibitörü&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>Ekstraselüler ortamdan gelen herhangi bir Nanoluc&amp;reg; sinyalini söndürür&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>Büyüme faktörleri sağlamak için</td></tr><tr><td>HEK293T Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>HeLa Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>HEP3B Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>HEPG2 Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>Huh7 Hücreleri</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>IncuCyte S3 Ters mikroskop</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>Sferoid oluşumunu/büyümesini izlemek için</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Görüntüleme Sistemi</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>Lüminesans için uç nokta okuması</td></tr><tr><td>Nano-Glo&amp;reg; Canlı Hücre Analizi&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>Canlı hücre tespiti için lüminesan substrat reaktifi</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için</td></tr><tr><td>Havalandırmalı T75 Doku Kültürü flaskları</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>Hücre büyütmek için kullanılan flasklar</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>Hücrelerin enzimatik olarak ayrıştırılması</td></tr><tr><td>Ultra düşük yapışma plakaları</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Sferoid oluşumunu teşvik etmek için hücre yapışmasını önler</td></tr></tbody></table>

aav transdüksiyon Çalışmaları için 3b sferoidlerin değerlendirilmesi

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

Adeno-associated virüsler (AAV'ler), gen tedavisi ürünlerinde gen aktarımı için kullanılan güçlü vektörlerdir. Bunların geliştirilmesi; vektör tasarımı, serotip performansı, düzenleyici element gücü ve ekspresyon kinetiğindeki farklılıkları güvenilir bir şekilde tespit edebilen in vitro&#160; sistemler gerektirir. Bu sistemler aynı zamanda potens değerlendirmesi ve vektör optimizasyonu gibi uygulamaları da desteklemelidir. Burada, çeşitli hücre hatlarında AAV potensini, transgen ekspresyon kinetiğini ve serotipe özgü transduksiyon etkinliğini değerlendirmek için optimize edilmiş, yalınlaştırılmış üç boyutlu bir sferoid platformunu tanımlıyoruz. Ultra düşük yapışmalı plakalar kullanılarak tekdüze sferoidler oluşturulmakta ve stabil mimari ile uzun süreli görüntülemeyi destekleyen koşullar altında tutulmaktadır. AAV transduksiyonunun ardından, floresan veya lüminesans okumalar canlı hücre görüntüleme sistemleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlenir. Bu, sürekli kinetik görüntüleme yoluyla reporter sinyalinin, doz yanıtının, düzenleyici element aktivitesinin ve başlangıç süresinin kantitatif değerlendirmesine olanak tanır. Platform, güçlü ve zayıf vektör genom tasarımları ile birden fazla AAV serotipi arasında etkili bir ayrım yapar. Bu yöntem, hem yavaş hem de hızlı bölünen hücre hatlarında güçlü bir performans sergilemektedir. Bu sonuçlar, sistemin preklinik gen tedavisi değerlendirmesi ve geliştirilmesi için ölçeklenebilir ve fizyolojik olarak ilgili bir sistem olarak faydasını ortaya koymaktadır.

Üç boyutlu sferoid kültür sistemleri, AAV gen terapisi geliştirmeleri için geleneksel 2D modellerine göre iyileştirmeler sunar. Bu metodoloji, düşük dozlarda AAV transdüksiyonunun hassas tespitini, artırılmış fizyolojik ilgiyi ve güçlü uzun süreli izlemeyi mümkün kılar. Platform; farklı hücre hatları ve AAV serotipleri genelinde etkinlik değerlendirmesini, yüksek kapasiteli taramayı ve vektör optimizasyonunu destekler.

AAV Transdüksiyon Çalışmaları için 3B Sferoidlerin Değerlendirilmesi

Adeno-ilişkili virüsler (AAV'ler), gen tedavisi ürünlerinde gen aktarımı için kullanılan güçlü vektörlerdir. Geliştirilmeleri, ... gerektiren in vitro sistemlere ihtiyaç duyar.

Gen tedavisi için vektör performansının öngörüsünü iyileştirmek ve AAV transduksiyon aktivitesini değerlendirmek amacıyla hassas, fizyolojik olarak ilgili bir 3B sferoid platformu geliştirdik. Bu protokol; vektör potens testi, serotip taraması, transgen optimizasyonu, nötralizasyon çalışmaları ve in vitro preklinik gen terapisinde AAV aktivitesinin değerlendirilmesi için uygulanabilir.Başlamak için, hücreleri standart koşullar altında %70 konfluens düzeyine ulaşana kadar bir T75 hücre kültürü flaskında büyütün. Hücreleri tripsinizasyon işleminden geçirdikten sonra, rutin hücre pasajlaması için 1:10 dilüsyon hazırlayın. Hücreleri tekrar %70 konfluense ulaşana kadar inkübe edin ve ardından hasat edin. Hücre canlılığını değerlendirdikten sonra, hücre süspansiyonunun iyice karıştığından emin olmak için pipetleme işlemini dikkatlice gerçekleştirin. Ultra-düşük yapışmalı 96 kuyucuklu bir plaka içinde, kuyucuk başına 200 µL hacimde 1 × 10⁴ hücre ile başlayarak hücrelerin iki katlı seri dilüsyonlarını yapın. Gösterilen deneysel düzene göre, en üst satır hariç tüm satırlara 1 birim komple besiyeri ekleyin. Ardından, en üst satıra kuyucuk başına 1 × 10⁴ hücre içeren iki birim ekleyin. 1A satırından bir birimi 1B satırına ekleyerek 1A satırını seri olarak dilüe edin ve aynı şekilde devam edin. Hücreleri merkeze toplamak ve hücre-hücre temasını teşvik etmek için ultra-düşük yapışmalı plakayı 350 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Sferoid oluşumu için 37 °C'de, rahatsız edilmeden 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Çapın yaklaşık 400 µm'ye ulaşması için üç gün bekleyin. Hücrelerin eşit şekilde resüspande edildiğinden ve plakaların düz olduğundan emin olarak sferoid boyut üniformitesini kontrol edin. Sferoid morfolojisini izleyin. Gevşek hücre agregatları yerine sıkı hücre-hücre adezyonu sergileyen olgun sferoidleri seçin.Hücre süspansiyonları çöktürüldükten sonra, plakayı canlı hücre görüntüleme cihazı ile donatılmış 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın. Görüntüleme yazılımına giriş yapın. Veri toplama için Schedule ve planlı tarama için Scan on schedule seçeneklerini, ardından yeni kap oluşturmak için Create vessel to New seçeneğini belirleyin. Tarama tipini seçip spheroid seçeneğini işaretleyin. İlgilenilen kanalları belirleyin. Bright field ile birlikte phase seçeneğini seçin. Ardından yeşil veya kırmızı rengi seçin. İstenen büyütmeyi 10x olarak ayarlayın. Plaka modelini ve çekmecedeki konumunu seçin. Görüntülenecek kuyucukları belirleyin ve deney adını girin. Analiz kurulumu için Differ analysis until later seçeneğini seçin. Taramaları her altı saatte bir eklenecek şekilde ve süresiz (indefinitely) olarak ayarlayın. Görüntüleme yazılımına giriş yaparak sferoid büyümesini günlük olarak kontrol edin. View recent scans seçeneğini belirleyin ve istenen deneye çift tıklayın. Görüntü kanalları panelinden Brightfield seçeneğini seçtikten sonra, sferoidlerin çaplarını ölçmek için Measure image özelliğini kullanın. Optimize edilmiş sferoid oluşumunun gerçekleştiği günde plakayı çıkarın ve adeno-associated virus (AAV) transdüksiyonu için kullanın.Antibiyotik içermeyen, %2 FBS ile takviye edilmiş DMEM'den 297 mikrolitre içeren 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plaka hazırlayın. Başlangıç enfeksiyon çokluğu veya MOI değerini 1 × 10⁶ yapmak için ortama 33 mikrolitre AAV stoğu ekleyin. Ardından, her dilüsyondan 33 mikrolitreyi 297 mikrolitre ortama aktararak 10 katlı seri dilüsyonlar hazırlayın. Daha önce hazırlanan sferoit plakasındaki tüm ortamı çok kanallı bir pipet kullanarak aspire edin. Dilüsyon plakasından, istenen MOI değerindeki 100 mikrolitre AAV'yi çok kanallı bir pipet kullanarak tedavi plakasına aktarın. Plakaları görüntüleme cihazına geri yerleştirin. 72 saat boyunca yeşil floresan yoğunluğunu takip ederek transduksiyon izlemeye başlayın. Besinleri yenilemek için her üç günde bir kuyucuk başına 100 mikrolitre tam DMEM ekleyin. Plakayı görüntüleme cihazına geri yerleştirin ve her altı saatte bir transduksiyon verimliliğini kaydetmeye başlayın. İlgilenilen hücrelere ve raporlayıcı genlere özgü bir analiz tanımı oluşturarak verileri analiz edin. Floresan okumalarını kullanarak uç nokta analizi gerçekleştirin. Benzer şekilde, lüminesans raporlayıcılara sahip 3B sferoitlerde AAV transduksiyonu gerçekleştirin ve ardından biyolüminesans görüntüleme kullanarak transduksiyon analizi yapın.Her bir hücre hattı, ekimden üç gün sonra belirgin morfolojik özellikler ve farklı sıkışma seviyeleri sergilemiştir. Hepatik hücre hatları, diğer hücre hatlarına göre daha sıkı ve daha yoğun sferoidler oluşturmuştur. HEK293T, belirgin bir nekrotik çekirdeğe sahip, oldukça yuvarlak bir sferik görünüm oluşturmuştur. A375 ise düzensiz şekilli bir hücre agregatı oluşturmuştur. Sferoidler AAV transdüksiyonuna karşı oldukça duyarlı bulunmuş olup, self-komplementer GFP için farklı hücre hatlarında çok düşük AAV titrelerinde bile güçlü transdüksiyon tespit edilmiştir. Tek zincirli GFP'nin sferoid transdüksiyonu, self-komplementer GFP'ye göre daha düşük seviyelerde gözlemlenmiştir. HEK293T hücrelerinde 10⁶ MOI değerinde, self-komplementer ve tek zincirli transgenler arasında göreceli floresans açısından 100 katlık bir fark gözlemlenmiştir. HEP3B hücrelerinde ise self-komplementer ve tek zincirli transgenler arasında göreceli floresansta üç katlık bir fark gözlemlenmiştir. Dört AAV serotipinin tamamı, hem floresan plaka okuyucu hem de canlı hücre görüntüleme sistemi kullanılarak başarıyla tespit edilmiştir. Her iki hücre hattında da en yüksek transdüksiyon etkinliğini AAV2 göstermiş, bunu AAV1 takip etmiştir. Tüm AAV serotipleri lüminesan sistem kullanılarak etkili transdüksiyon göstermiş ve bu durum transdüksiyon etkinliğinin kesin olarak ayırt edilmesini sağlamıştır. HeLa sferoidlerinde en etkili serotip AAV2 iken, en düşük transdüksiyon etkinliği AAV9'da görülmüştür. AAV2 self-komplementer GFP transdüksiyonu, 10¹ kadar düşük enfeksiyon oranlarında tespit edilebilmiş ve tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla yaklaşık 34 saat sonra sinyalde belirgin bir artış gözlemlenmiştir. AAV2 tek zincirli GFP sinyali, self-komplementer GFP sinyaline göre daha zayıf ve daha yavaş gerçekleşmiştir.Bu protokolü uygularken temel zorluk, yüksek hücre canlılığını korumak, tekdüze ve kompakt sferoidler üretmek ve her hücre tipi ile serotip için AAV dozajını optimize etmektir. Bu protokol; RT-qPCR, Western blotting, ELISA'lar, somatik aktivite analizleri ve başlangıç zamanı kinetik analizi kullanılarak transgen ekspresyonunu ve fonksiyonelliğini değerlendirebilir. Gelecekteki çalışmalar, in vivo mikroçevreyi daha iyi taklit etmek için ko-kültürleri, organoidleri, mikroakışkanları, bağışıklık hücrelerini veya damar yapılarını entegre edebilir.

evaluation-of-3d-spheroids-for-aav-transduction-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makalede, insan karaciğer kanser hücrelerini hedef için en verimli bir vektör olarak adeno-ilişkili virüs serotip 3 (AAV3) tanımlanması için.

Rekombinant Adeno Associated Virus serotip 3 Vektörler Karaciğer Kanseri Hücreleri Yüksek Verimlilik İletimi

Biz, moleküler DNA aile karıştırma yoluyla sentetik Adeno ilişkili viral (AAV) gen tedavisi vektörleri mühendisi ve gelişmeye temel tekniği göstermek. Ayrıca, biz seçimi ve kültür veya farelerde hedef hücreler üzerinde gelişmiş özellikleri ile bireysel kimerik capsids analizi için genel kurallar ve temsili örnekler sunuyor.

DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Retina hastalığının hayvan modellerinde kan-retina bariyeri geçirgenliğini ve iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü araştırmak için, retinal nöronları ve gliaları etiketlemek için araç olarak birkaç adeno-ilişkili virüs (AAV) varyantı kullandık. Virüs aracılı raportör gen ekspresyonu daha sonra retinal bariyer geçirgenliğinin bir göstergesi olarak kullanılır.

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

Burada, biz üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji, titresi ve adeno ilişkili virüs vektörlerin kalite kontrol toplu işlemleri açıklanmaktadır. Bir vektör hazırlık ile yüksek-titresi elde etmek kullanýcýnýn (≥1 x 1013 vektör genleri/mL) ve yüksek saflıkta, vitro veya vivo içinde kullanıma hazır.

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Bu yöntem, floresan etiketli sarkomere proteinleri ile pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler kullanarak sarkomere kısaltmasını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Etiketli Sarkom Proteinleri kullanılarak Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerin Sarkomer Kısaltılması.

Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.

HEK293 Süspansiyon Hücreleri Kullanılarak Yüksek Verimli Adeno İlişkili Vektör Partilerinin Üretimi

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Burada, yetişkin farelerde adeno-ilişkili virüsü (AAV) sistemik olarak uygulamak için fare lateral kuyruk veni enjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırıyoruz. Ek olarak, AAV transdüksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan tahlillerin protokollerini açıklıyoruz.

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Bu rapor, fare böbreğine etkili ve güvenli gen transferi için renal pelvis yoluyla AAV vektörlerinin lokalize enjeksiyon yöntemini detaylandırmaktadır.

Adeno ilişkili virüs vektörlerinin yavaş retrograd renal pelvis enjeksiyonu yoluyla fare böbreğine etkili ve güvenli gen iletimi

Öğrenin, AAV transdüksiyon etkinliğini ve transgen ekspresyon kinetiğini değerlendirmek için 3B sferoid platformunu nasıl kullanacağınızı. Bu yöntem, gen tedavisi vektör optimizasyonu için sağlam, nicel ve gerçek zamanlı bir değerlendirme sunar.

AAV Transdüksiyon Çalışmaları için 3B Sferoidlerin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet