Donmuş Buffy Tüy Örneklerinden İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Hatlarının Yeniden Programlanması

Bu protokolün amacı, insan donmuş buffy tüylerini veya PBMC'lerini indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlamaktır. Bu protokol, çözüldükten sonra buffy tüyleri benzersiz şekilde temizler ve yeniden programlama başarısının göstergesi olan somatik bir hücre morfolojisini tanımlar. Başlamak için, insan kanından elde edilen donmuş buffy paltoyu alıp buzun üzerine koyun.

Örneği 37 derece Santi-celsius su banyosunda nazikçe karıştırın ve sadece küçük bir buz kristali kaldığında şişesini çıkarın. Şişenin içeriğini dikkatlice 12 mililitre DPBS içeren konik bir tüpe damla olarak aktarın. Şişeyi bir mililitre DPBS ile durulayın ve duralamayı alınan hücrelerin bulunduğu konik tüpe ekleyin.

Numuneyi 200 g oda sıcaklığında sallanan kovalı rotor kullanarak 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre pelletini %1 FBS içeren dört mililitre DPBS ile yeniden askıya alın. Sonra, buffy kaplama karışımını üç mililitre yoğunluk gradyanı çözeltisi üzerine nazikçe katmanlayın, arayüzde karışmayı önleyin.

800 g ağırlığında 20 dakika boyunca oda sıcaklığında fren kapalı bir şekilde santrifüj yapın. Pipet kullanarak, üst plazma tabakasını çıkarıp gradient arayüzü bozmadan atabilirsiniz. Sonra arayüzdeki periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) tabakasını çıkarıp temiz bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.

PBMC'leri üç mililitre genleşme ortamı ekleyerek ve oda sıcaklığında 200 g santrifüjle yaparak 10 dakika boyunca yıka. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve peleti SCF, IL-3, EPO ve IGF-1 gibi sitokinler içeren iki mililitre genleşme ortamında yeniden süskü edin. Hücreleri 12 kuyruklu bir plakanın 1 kuyusuna yerleştirin.

Hücreleri 37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit ve %20 oksijen ile 10 ila 14 gün boyunca kültürleyin. Ortamın yarısını her iki günde bir değiştirin, ta ki hücrelerin transdüksiyona hazır olduğunu gösteren yoğun parlak, yuvarlak eritrop popülasyonu gözlemlenene kadar. Yamanaka faktörlerini taşıyan Sendai virüsüyle transdüksiyondan üç gün sonra, hücreleri fare embriyonik fibroblastlarına iki mililitre kuyu başına yerleştirilir.

Kültürleri yaklaşık yedi gün kuluçka altına alın, yeni kolonilere her iki günde bir hESC medyası ile besleyin. Transdüksiyon edilen hücreleri ve ortaya çıkan kolonileri içeren plakayı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Mikroskopla bir koloniyi bulup plakanın kapağını açığa çıkarıp kuyuyu ortaya çıkarın.

Şırıngayı aseptik açıp iğneyi açığa çıkar. Mikroskop rehberliğinde, iğne ucunu kullanarak koloninin çevresindeki besleyici hücrelerden koloninin konturunu izleyerek ayırın. İğne ucunu kullanarak koloniyi birkaç eşit boyutta parçalara böl.

Parçalar ayrılmadıysa, iğnenin yanını kullanarak onları tabaktan alıp ya da kazıyarak yüzmeye başlayın. Şimdi bir P200 pipeti kullanarak, seçilmiş koloniyi mikroskop altında konumlandırın, pipetle yüzen koloniyi aspire edin ve hazırlanmış 24 kuyu plakasının bir kuyusuna aktarın. Tüm koloninin başka koloniler veya besleyici hücreler toplamadan transfer edilmesinden emin olun.

Plakayı inkubatöre 37 derece Celsius sıcaklığında, %5 karbondioksit ve %20 oksijen ile yerleştirin, ta ki istenen birleşim sağlanana kadar. Bölünmeye hazır olarak büyük, yuvarlak ve parlayan kenarları olan kolonileri belirleyin. Kuyudaki ortamı aspire edin ve örneği bir mililitre DPBS ile bir kez durulayın.

Sonra DPBS çıkarılır ve 500 mikrolitre 0.5 milimolar EDTA dissosiyasyon tamponu eklenir. Örneği 37 derece Celsius sıcaklığında %5 karbondioksit ile iki dakika boyunca kuluçka yapın, ta ki kolonileri gevşedikten ve hücreler toparlanana kadar. Sonra, plakayı kuluçka makinesinden çıkarın ve EDTA dissosiyasyon tamponunu aspire edin.

P1000 pipeti kullanarak, hücreleri bir mililitre insan pluripotent kök hücre ortamıyla toplayın; kolonileri nazikçe yukarı aşağı pipetleyerek koloniler ayrılıp hafifçe parçalanana kadar. Bir mililitre ortam ve hücreleri, taze insan pluripotent kök hücre ortamı içeren yeni altı kuyu tabakasına aktarın. Hücreleri inkübatöre 37 derece Celsius sıcaklığında, %5 karbondioksit ve %20 oksijen ile yerleştirin.

Kuyu birleşip bölünmeye hazır olana kadar indüklenmiş pluripotent kök hücreleri her gün besleyin. Bu arada, 10 santimetrelik bir kabı DPBS'de hazırlanmış 7 mililitrede beş mikrogram vitronektin çözeltisi ile kaplayın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçka yapın. Bölünmeye devam etmek için, 10 santimetre kaba 7 ila 10 mililitre insan pluripotent kök hücre ortamı ekleyin ve hücreleri altı kuyu tabaktan tabağa 1:1 oranında aktarın ve daha önce gösterildiği gibi kuluçka yapın.

10 santimetrlik çanaktaki hücrelerin birleşip birleşip gittiğini doğrulayın, sonra hücreleri tekrar ayırın. Bölünme oranını hücre morfolojisi ve yoğunluğuna göre ayarlayın; genellikle 1:10 oranı kullanarak ve her pasajda geçiş sayısını not edin. Son olarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri, kök belirteci NANOG ifadesini immünofluoresans kullanarak doğrulayarak karakterize edin.

Hücreleri tanımlanmış kültür koşulları kullanarak ektoderm, mezoderm ve endoderm hatlarına ayırın. PAX6, Brachyury ve SOX17 için boyama ile NANOG ekspresyonu kaybı ile birlikte farklılaşma potansiyelini değerlendirin. Genişleme sonunda, PBMC'ler eritroplara ayrılarak büyük ve küçük boyutlu parlak, yuvarlak hücreler olarak ortaya çıktı.

Bu hücrelerden yoksun veya ölü görünen kültürlerin başarılı bir şekilde yeniden programlanması pek olası değildi. Başarılı transdüksiyon ve yeniden programlama, ışınlanmış besleyici hücrelerde indüklenmiş pluripotent kök hücre kolonilerinin ortaya çıkmasıyla karakterize edildi ve bu koloniler tipik kök hücre morfolojisi geliştirdi. Oysa kök hücre benzeri morfolojiyi benimsemeyen hücreler başarılı bir şekilde yeniden programlanamadı.

Başarıyla yeniden programlanmış indüklenmiş pluripotent kök hücreler, pürüzsüz, parlak kenarlara sahip yoğun, yuvarlak koloniler sergilemiştir. Daha az ideal morfolojiye sahip alt klonlar ise, örneğin spontan diferensiya veya yoğun merkezler, bölünme koşulları ayarlanarak temizlendi. Bazı seçilen koloniler başarılı bir şekilde genişlenemedi.

Morfolojiye ek olarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler, kök belirteci NANOG'un ekspresyonuyla da kanıtlandığı şekilde köklülük göstermiştir. Yeniden programlanmış indüklenmiş pluripotent kök hücreler, ektoderm, mezoderm ve endoderme farklılaşma potansiyeli göstermiştir. Bu protokol, yeniden programlama başarısını takip etmek ve tahmin etmek için ayrıntılı kontrol noktaları sağlar.

iPSC hattının kullanıma uygun olup olmadığını daha iyi doğrulamak için karyotipleme, genotipleme ve düzenli mikoplazma testi yapılmalıdır. Bu protokol, mevcut hasta popülasyonlarından biyobankalı buffy coat'larla yeniden programlanmasına olanak tanır ve iPSC teknolojisinin faydasını genişletir.