Biyomoleküler yoğunlaşmaları iki fazlı koşullarda karakterize etmek için çözelti NMR kullanımı

Biyomoleküler kondensatları incelemek için NMR yöntemleri geliştirdik. Bunlar hücresel organizasyon için anahtardır, ancak sürekli bilgileri birden fazla hastalıkta ima edilir. Yöntemlerimizi kullanarak kondensat malzemesinin özelliklerini inceler, oluşum mekanizmalarını analiz eder ve kondensat olgunlaşması veya biyomoleküllerin patolojik fibrilasyonu gibi uzun vadeli değişiklikleri izliyoruz.

Başlamak için, protein stoklarını, RNA stoklarını veya her ikisini ilgili sıcak agaroz tamponu ile 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde karıştırarak agaroz hidrojel ile stabilize edilen son bifazli örneği hazırlayın. NMR tespiti için nihai protein veya RNA konsantrasyonu genellikle 50 ila 500 mikromolar arasındadır. Hazırlanan bifazik örneği spektrometreye yerleştirin, sonra proton kanalını her zamanki gibi kilitleyin, şimize ekleyin, eşleştirin ve ayarlayın.

Proton kanalındaki 90 derecelik darbe uzunluğunu genel kalibrasyon prosedürünü kullanarak kalibre edin. Sonra tek boyutlu su baskılı bir spektrum kaydedin ve spektrumun güçlü biyomoleküler sinyaller içerip içermediğini kontrol edin. Eğer sinyal yok veya çok az sinyal gözlemlenmiyorsa, REDIFINE ile devam etmeyin, bunun yerine CONDENSE-MT kullanın.

Difüzyon gradyanı gücünü %2'den %95'e kadar 16 doğrusal adımda dizelemek için bir difüzyon sıralı spektroskopi deneyi kaydedin. Tam REDIFINE seti için veri toplamaya devam etmek için, yeni yürütülen ilk deneyden parametreleri kopyalayarak dokuz yeni aşamalı PPP GPQ S19 deneyi oluşturun. Her ardışık deneyde, sadece D20 difüzyon gecikmesini değişken adımlarla değiştirerek 100 ile 1000 milisaniye aralığını kapsayabilir.

Bu deneylerin her birini uygun komutla çalıştırın. Son N'yi alıcı kazancını korumak için 10 deney boyunca kullanın. Q işaretini pencere fonksiyonu olarak SSB2 ile ayarlayın.

Sonra beşinci dilimi uygun komutla çıkarın. Tek boyutlu spektrumu fazlayın ve fazlalama parametrelerini iki boyutlu veri setine kaydedin. İki boyutlu veri setini XF2 ile işleyin ve ABS2 ile temel düzeltme yapın.

Sonrasında, bölünmüş 2D ile 16 dilimi çıkarın. Kalan dokuz deney için benzer prosedürü tekrarlayın. Doğru faz ve temel düzeltme için en az ilk dört-beş dilimi kontrol edin.

Gerekirse, faz ve temel çizgiyi manuel olarak düzeltin. Sonra analiz için uygun MATLAB kodunu kullanın. Kodda, difüzyon sürelerini değiştirin, PG değerlerini prob gradyan şiddetlerine göre ayarlayın ve deneylerin toplam sayısına göre birden 10'a kadar deneyler atanır.

Sonra verileri bu kodla REDIFINE modeline göre uyarlayın. 1D su bastırılmış spektrumu kaydedin. Çok az sinyal gözlemlenirse, CONDENSE-MT deneyine devam edin.

Su oranını T1 ters geri kazanımı ile CONDENSE-MT için nicel olarak belirleyin. Verilen darbe dizisini ve VD listesini ilgili klasörlere kopyalayın. Protonun 90 derece darbesi kalibre edildikten sonra NS 2, DS 0, D1 20 saniye, SW ise 10 milyon parça ayarlandı.

TD2'den 16K'ya, TD1'den 24'e. CONDENSE-MT deneyi için, verilen Bruker parametre seti, sırası ve frekans listesini Bruker'e özgü klasörlere kopyalayın. Sonra frekansları ve gücü spektrometreye göre ayarlayın.

Radyasyon sönümünü önlemek için uyarılma darbesi için P1'i kalibre edilmiş 90 derecelik darbe uzunluğuna, P4'ü ise bir mikrosaniyeye ayarlayın. NS'yi 2'ye, DS'yi 16'ya, D1'i dört saniyeye, SW2'yi 20 milyonda bir parçaya, TD2'yi 8k'ye ve TD1'i frekans listesinin uzunluğuna ayarlayın. SPNAM10 Squa100,000'e ayarlayın ve P10'u beş saniyeye ayarlayın.

100 hertz ışın sağlayan SP10 gücünü bulun. Işıtlama darbesinin SP10 gücünü buna göre ayarlayın. Uygun komutla sahte iki boyutlu deneyi çalıştırın ve SP10 ışınlama güçlerini değiştiren bu sözde 2B deneylerden bir dizi kurun.

Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, kodu çalıştırarak su sinyalini entegre edip yeni bir değişkene kaydeden NMR spektrumlarını okuyun. Kod ters çevirme kurtarmasında yolu uygun veriye ayarlayın ve su entegrasyon bölgesini kontrol edin. Sonra, ters dönüş kurtarma verilerini içeren deney sayısını ayarlayın.

Tüm deneysel parametreleri ayarlayın ve agarose veri setini benzer şekilde uyarlayarak daha önce elde edilen agarose boş havuz değerlerini girin. Su boylamasına gevşeme uyumunu elde etmek için yoğunlaştırılmış boş kodun ilk bölümünü çalıştırın. Sonra yoğun boş fiting bölümünü çalıştırarak uyum fonksiyonunun en aza indirilmesini gösteren canlı şekli başlatın.

Belirsizlikleri belirlemek ve verileri çizmek için kodun sonraki bölümünü çalıştırın. REDIFINE uyumu, seyreltilmiş ve yoğunlaşmış fazlarda difüzyon katsayılarını, yoğunlaştırılmış fazdaki protein popülasyonunu, ortalama damla boyutunu ve FUS N-terminal alan örneğinin fazlarası geçirgenliğini belirledi. FUS N-terminal alanının NMR sinyali yoğunlaşmış fazda tespit edilebilir kaldı.

Fazik örnekle agaroz referansı ile FUS N-terminal alanı arasında manyetizasyon transfer profilinde herhangi bir fark gözlemlenmemiştir. CAG tekrarlayan RNA kondensatları için NMR sinyali gözlemlenmez. Buna göre, manyetizasyon transfer profili agaroz referansından önemli ölçüde farklıdır.

CONDENSE-MT deneyi, tekrar genleşme RNA kondensatlarının dinamik karakterizasyonunu sağladı. CONDENSE-MT analizi, yoğunlaşma ile toplu su arasındaki proton değişim kinetiklerini ortaya çıkardı. CONDENSE-MT analizi ayrıca yoğunlaşmadaki RNA'nın enine gevşeme süresini ve toplu suyun görünen enine gevşeme oranını da ortaya koydu.

Bu protokolde, kimyasal etikete ihtiyaç duymadan iki fazlı bir durumda kondensat özelliğini karakterize edebiliriz. Damlacıklar, seyrelmiş bir ortamla birlikte var olur ve bu da hücresel ortamı taklit eden iki faz arasında değişim sağlar. Kondensatın karakterizasyonuna odaklanan yöntemlerimiz, moleküler yapı etkileşimlerini ve fazlar dinamiğini incelemek için geleneksel NMR yöntemleriyle tamamlanabilir.

Gelecekteki çalışmalarda, daha karmaşık kondensat modelleri geliştirmeyi, metodolojiyi daha karmaşık sistemlere uyarlamayı ve sonunda kondensatı doğrudan hücre içi ortamlarında incelemeyi hedefliyoruz.