24 kuyu rafları kullanarak orta verimlilikli kolon DNA çıkarımı
24 Temmuz 2026
Bu protokol, plazmid DNA çıkarımını hızlandırmak için maliyet etkin bir yöntem tanımlar. Standart sallanan kovalı plaka rotorlarıyla uyumlu özel 3D baskılı raflar kullanılarak, araştırmacılar aynı anda 48 döner kolonunu kapaklı veya 116 döner kolonunu kapaksız işleyebilir; bu da manuel mikrosantrifüj yöntemlerine kıyasla kullanım süresini önemli ölçüde azaltmaktadır.
Araştırmamız, manuel ve otomatik yöntemler arasında köprü kuran, paralel spin-kolon DNA ve RNA ekstraksiyonu için 3D yazıcıyla üretilmiş raklara odaklanmaktadır. Bu çalışma, 116'ya kadar DNA veya RNA örneğinin eş zamanlı olarak işlenmesine olanak tanıyarak, iş gücü yoğun manuel spin-kolon yöntemlerinin kısıtlamalarını gidermektedir. Başlamak için, rakla yazdırmak amacıyla 0,4 milimetre nozullu bir eritme telli modelleme (FFF) 3D yazıcısı kullanın.
%100 doluluk oranına sahip genel polilaktid (PLA), polietilen tereftalat glikol (PETG) veya akrilonitril bütadien stiren (ABS) filament kullanın. Katman yüksekliğini 0,1 milimetre olarak ayarlayın ve yüzey düzeltmeyi etkinleştirin. Su sızdırmazlığını ve mekanik stabiliteyi sağlamak için baskı ayarlarını düzenleyin.
Raftları ilk kez kullanmadan önce sızdırmazlık açısından test edin. Kullanım öncesinde testi gerçekleştirmek için basılı rezervuarı %70 ethanol ile doldurun. Sızıntı veya yapısal hasar olmadığını doğrulamak için kademeli olarak artan sürelerde santrifüjleyin.
Yapıştırıcı kullanarak yapılan testler başarıyla tamamlandıktan sonra, sızdırmaz bir ünite oluşturmak için taban rezervuar bileşenlerini birbirine birleştirin. Escherichia coli veya E.Coli transformantlarını, uygun antibiyotikler içeren üç ila beş mililitre lizojeni broth veya LB besiyerine inoküle edin. Kültürü, çalkalamalı inkübatörde 37 °C'de 12 ila 16 saat boyunca inkübe edin.
Hücreleri toplamak için 2000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın. Pellete 250 microliter yeniden süspansiyon tamponu ekleyin.
Ardından, peleti vorteksleyerek veya pipetleyerek tamamen yeniden süspanse edin. 250 µL lizis tamponu ekleyin. Tüpü dört ila altı kez tersyüz ederek veya 24 kuyucuklu plakayı sallayarak nazikçe karıştırın.
350 µL nötralizasyon tamponu ekleyin ve karıştırın. Başarılı bir nötralizasyonu onaylamak için beyaz bir çökelek oluşumunu gözlemleyin. Titanyum dioksit tozu içeren bir tüpe lizis tamponu ekleyin.
İkiye bir hacim-kütle oranı ekleyin. Lizata 250 µL titanyum dioksit süspansiyonu ekleyin. Tüpü çalkalayarak karıştırın.
350 µL nötralizasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. 2000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Titanyum dioksit varlığında hücre peletinin tamamen çöktüğünü ve süpernatanın tamamen şeffaf göründüğünü gözlemleyin.
Titanyum dioksit yokluğunda, süpernatantta kalıntı sedimentin varlığını not edin. Çökelmeyi rahatsız etmeden süpernatantı toplayın ve bağlama kolonuna aktarın. DNA bağlama kolonlarını, rafın kolon tutucu katmanına yerleştirin.
Santrifüjleme sırasında sabit kalmaları için kolon kapaklarını belirlenmiş yuvalara yerleştirin. Berraklaştırma veya filtre kolonlarını, bağlama kolonlarının hemen üzerindeki filtre kolonu katmanına yerleştirin. Hazırlanan nötralize lizatı filtrasyon kolonlarına aktarın.
Birleştirilmiş rafı, sallanan kova plakalı bir rotora yerleştirin. Oda sıcaklığında, 2000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Rafı santrifüjden çıkardıktan sonra, filtre kolon katmanını çıkarın ve atın.
Rezervuardan gelen akış sıvısını bir atık kabına boşaltın. Bağlama kolonlarını kullanarak rafı tekrar birleştirin. Her bir bağlama kolonuna 500 ila 700 µL yıkama tamponu ekleyin.
2000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Rezervuardaki akış sıvısını atın ve daha önce gösterildiği gibi yıkama adımını tekrarlayın. Bağlama kolonlarını raktan çıkarın ve iki mililitrelik toplama tüplerine aktarın.
Membranı kurutmak için 10,000 G veya daha yüksek hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Kolonları temiz 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Membran üzerine doğrudan 50 mikrolitre elüsyon tamponu veya su ekleyin ve kolonları oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin.
DNA'yı elüe etmek için 10, 000 G veya daha yüksek hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Toplam plazmit verimi, geleneksel yöntem ile raf konfigürasyonları kullanılarak yapılan ekstraksiyon arasında anlamlı bir fark göstermemiştir. Plazmit doğrulaması; relaks, lineerize ve süper kıvrımlı formların benzer dağılımlarıyla korunmuştur.
Boya dağılımı, yüklü kolonların hemen altındaki atık alanı ile sınırlı kalmış; bitişik kuyucuklarda veya komşu kolon uçlarında görünür bir sinyal saptanmamıştır; bu durum, raf tasarımının sıçrama ve kolonlar arası transfer olasılığını azalttığını göstermektedir. Amplifikasyon, yalnızca amplikon eklenen kolonlardan elde edilen elüsyonlarda saptanmıştır. Bu partikül, araştırmacıların klonlama, sekanslama ve PCR analizi dahil olmak üzere sonraki uygulamalar için yüksek kaliteli plazmid DNA elde etmelerini sağlar.
Bu protokolü uygularken en önemli husus, su sızdırmaz, taşma yapmayan ve 3D yazıcıyla üretilmiş rezervuarlar kullanarak çapraz kontaminasyonu önlemektir. Ek olarak, bu prosedürün ardından söz konusu raflar, kolon tabanlı tüm nükleik asit ekstraksiyon analizleri için kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu makale, silika membranlı spin kolonlar kullanan, yüksek kapasiteli DNA ekstraksiyonu için yarı otomatik ve ölçeklenebilir bir yöntemi tanıtmaktadır. Standart santrifüj plaka rotorlarıyla uyumlu, özel 3D baskılı raflardan yararlanan bu yaklaşım, geniş örnek gruplarının verimli bir şekilde paralel olarak işlenmesini sağlayarak, pahalı otomatik sıvı taşıma sistemlerine karşı maliyet etkin bir alternatif sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Moleküler biyoloji
- Genomik
- Laboratuvar otomasyonu
Arka Plan
- Silika membranlı spin kolon ekstraksiyonu, yüksek kaliteli DNA saflaştırması için yaygın olarak kullanılmaktadır.
- Manuel işlem yapma süreci emek yoğundur ve çok sayıda örnek için ölçeklendirilmesi zordur.
- Otomatik sıvı taşıma robotları, küçük laboratuvarlar için genellikle aşırı maliyetlidir.
- DNA ekstraksiyonu için uygun maliyetli ve ölçeklenebilir çözümlere ihtiyaç duyulmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Basitleştirilmiş, yarı otomatik bir DNA ekstraksiyon iş akışı geliştirmek.
- Standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak yüksek verimli işlemeye olanak tanıyan 3D baskılı raflar tasarlamak.
- Manuel miniprep yöntemleri ile maliyetli otomasyon arasındaki boşluğu doldurmak.
Kullanılan Yöntemler
- Spin kolonlar için özel tasarlanmış, 3D yazıcıyla üretilmiş raflar.
- 116 adede kadar ticari spin kolonun paralel olarak işlenmesi.
- Tek bir santrifüj adımında eş zamanlı lizat berraklaştırma ve DNA bağlanması için iç içe geçmiş konfigürasyon.
- Yıkama adımlarını ve atık yönetimini kolaylaştırmak için ortak atık rezervuarı.
Ana Sonuçlar
- DNA verimi ve saflığı, standart manuel protokollerle kıyaslanabilir düzeydedir.
- 24 örneği aşan seriler için toplam işlem süresi %50–70 oranında azalır.
- Seri boyutundan bağımsız olarak filtrasyon, yıkama ve atıkların bertaraf edilmesi için gereken işlem süresi 5–10 dakika kısalır.
- Sistem, küçük ve orta ölçekli laboratuvarlar için açık kaynaklı ve maliyet etkindir.
Sonuçlar
- Yarı otomatik sistem, DNA ekstraksiyonu için işlem hacmini ve verimliliği önemli ölçüde artırır.
- Birçok laboratuvar için tam otomasyona pratik ve ekonomik bir alternatif sunar.
- Bu yaklaşım, yüksek hacimli DNA saflaştırma teknolojisine erişimi demokratikleştirmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Verimli ve ölçeklenebilir DNA ekstraksiyonu, genomik tabanlı ilaç keşfi ve tarama iş akışlarında kritik bir darboğazdır. Bu yarı otomatik, orta ölçekli sistem, tam otomasyonun maliyet ve iş gücünün çok küçük bir kısmıyla yüksek kaliteli nükleik asit saflaştırması sağlayarak, büyük sermaye yatırımları yapmadan örnek kapasitesini artırmak isteyen biyofarma Ar-Ge ekiplerini doğrudan destekler. Bu yaklaşım, manuel miniprep yöntemleri ile pahalı robotik sistemler arasındaki boşluğu doldurarak, keşif süreçleri boyunca operasyonel esnekliği ve kaynak tahsisini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Genetik tarama ve hedef belirleme çalışmalarını desteklemek için hızlı ve paralel DNA ekstraksiyonu sağlar.
- Yolak sorgulama ve mekanistik çalışmalar için yüksek kapasiteli örnek işlemeyi kolaylaştırır.
- Örnek tutarlılığını artırarak sonraki moleküler analizlerdeki değişkenliği azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz geliştirme, genotipleme ve moleküler tarama platformları için yüksek kaliteli DNA hazırlar.
- Manuel işlem basamaklarını minimize ederek standardizasyon ve tekrarlanabilirliği destekler.
- Yığın işlemeler için verimli bir şekilde ölçeklenerek, güçlü bileşik veya genetik kütüphane taramasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Biyobelirteç keşfi ve doğrulama çalışmaları için güvenilir DNA ekstraksiyonu sağlar.
- Tutarlı nükleik asit kalitesi gerektiren translasyonel araştırmalar için örnek bütünlüğünü korur.
- Daha büyük örnek setlerini destekleyerek erken keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yarı otomatik ekstraksiyon sistemi, erken keşif ile preklinik iş akışları arasına yerleşerek hipotez odaklı çalışmalardan yüksek verimli tarama ve translasyonel araştırmalara sorunsuz bir geçiş sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Çeşitli örnek setlerinden verimli DNA ekstraksiyonu sağlayarak hipotez testlerini ve yolak analizlerini destekler.
- Tarama: Alt akış moleküler analizleri ve tarama platformları için uygun, tekrarlanabilir ve kantitatif DNA verimi sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler ve deneysel koşulların istatistiksel değerlendirmesi için tutarlı nükleik asit girdisi sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Ölçeklenebilir, yüksek kaliteli DNA hazırlığı gerektiren biyobelirteç ve preklinik çalışmalarla uyumludur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla Ar-Ge programında tekrarlı kullanım için açık kaynaklı ve uyarlanabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Deneyler boyunca DNA kalitesini ve tutarlılığını sağlayarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Büyük partiler için manuel iş gücünü ve işlem süresini %50–70 oranında azaltarak laboratuvar verimliliğini artırır.
- Stratejik Değer: Büyük sermaye harcamaları gerektirmeden genomik iş akışlarının maliyet etkin şekilde ölçeklendirilmesini sağlar.
- Portföy Etkisi: Birden fazla proje için daha yüksek kapasiteli ve tekrarlanabilir örnek işlemeye olanak tanıyarak riskten arındırılmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Temel moleküler biyoloji uzmanlığı ve spin kolon protokollerine aşinalık gerektirir.
- Standart santrifüj plaka rotorlarına ve 3D yazıcıyla üretilmiş raf bileşenlerine erişim gereklidir.
- Tutarlı operasyon ve veri kalitesi için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Santrifüj kapasitesi sınırları dahilinde, çeşitli örnek tiplerine ve işlem hacmi ihtiyaçlarına uyarlanabilir.
- Açık kaynaklı donanım mevcudiyetine ve yerel üretim kapasitelerine bağlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:28
Preparation of 3D-Printed Equipment
1:34
Preparation of Bacterial Culture and Cell Lysate
2:43
Preparation of Lysate Using Titanium Dioxide Co-Precipitation
3:41
Assembly of the Filtration Unit for Lysate Clearance and DNA Binding
4:27
Washing and Elution of DNA
5:32
Results
6:22
Conclusion
