Yağlı stromal damar fraksiyonunda yansıtılan ışık kullanılarak yaşlanma tespiti

Obezite ve hiperinsülinimi gibi farklı yağ depoları ve metabolik durumlar arasında adiposit yaşlanmasını inceliyoruz. Geleneksel Brightfield tabanlı SABG testleri çok fazla uzatmaya izin vermez ve çok özneldir. Yeni protokolümüz daha az öznel ve çoklu ekleştirmeye izin veriyor.

Başlamak için, insan yağ dokusunu içeren tüpü alın. 10 gram yağ dokusunu homojenize edin ve %0,05 tip birinci kollajen enzim içeren bir tüpe ekleyin; böylece yaklaşık bir milyon stromal damar fraksiyonu (SVF) hücresi elde edilir. Her 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 500.000 hücre koy.

Hücre fiksasyonu için tüpe bir mililitre %2 paraformaldehit ekleyin. Sonra, oda sıcaklığında sallanan bir sallada 20 dakika kuluçka yapın. 600G'de 10 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın.

Üreticinin talimatlarına göre yaşlanma beta-galaktosidaz boyama kiti kullanarak X-Gal boyama çözeltisi hazırlanır. Üç yeni tüpe bir mililitre boyama çözeltisi ekleyin. Ve pH'ı bir moler hidroklorik asit veya bir molyar sodyum hidroksit çözeltisi kullanarak beş, altı ve sekize ayarlayın.

pH doğrulamak için kalibre edilmiş bir pH ölçer kullanın. 500.000 hücre içeren etiketlenmiş tüplerin her birine pH ayarlanmış X-Gal boyama çözeltisi ekleyin. 37 derece Celsius'ta 24 saat boyunca karbondioksit kullanmadan kuluçka yapın.

Hücreleri 600G ile 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatant çıkarıldıktan sonra hücreleri PBS ile yıkayın. Ve tekrar 600G'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.

Süpernatant çıkarıldıktan sonra, heterojen SVF içindeki endotel hücrelerini tanımlamak için, hücreleri endotel hücresine özgü CD31 ile kuluçka edinin veya gece boyunca dört derece Celsius'ta IgG birincil antikorlarını kontrol eder. Hücreleri 0,1% PBST ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir sallayıcı üzerinde üç kez yıkayarak bağlanmamış birincil antikoru çıkarın. Ve 600G'de 10 dakika santrifüj yapın.

Süpernatant atıldıktan sonra, hücreleri ikincil bir antikorla oda sıcaklığında bir saat boyunca bir sallayıcı üzerinde kuluçka yapın. İkincil antikor boyama çözeltisini çıkarmak için 600G boyunca 10 dakika santrifüj yapın. Hücreleri PBST ile üç kez yıkayın ve ardından daha önce gösterildiği gibi santrifüj yapın.

Antiifade montajında hücreleri yeniden askıya alın. Hücre askısını mikroskop slaytlarına pipetleyin ve hücreleri hareketsiz hale getirmek için gece boyunca oda sıcaklığında kürleyin. Ertesi gün, 100 mikrolitre %100 gliserol ekleyin.

Üzerine bir kapak koyun, tırnak ojesi ile kapatın. Hazırlanan slaytı konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin. Mikroskop yazılım arayüzünde, Işık Yolu seçeneğini seçin ve ışın bölücü ayarını T90R10'a ayarlayın.

Sonra, Mirror ayarında ikincil dikroik aynalar (SDM) için kesme dalga boyu değerlerini doğrulayın. Dedektör menüsünde, kanalları ve uyarılma dalga boylarını atamak için Boya ve Dedektör Seçimi seçeneğine tıklayın. Sonra, her belirli lazer için lazer güç yoğunluğu yüzdesi değerlerini %10 ile %15 arasında ayarlayın. Seri menüsünde, LSM bölümünde, Z seçeneğini Açık olarak değiştirin. Z adım boyutunu sistem optimumu olan 0,74 mikrometreye ayarlayın.

Sonra, Z Bölümü menüsünden başlatma giriş alanı değerini girin ve tam hücre hacmini yakalamak için membran sinyaline dayalı bir Z yığını tanımlayın. Acquire panelinin altında, LSM giriş alanına dosya adını ve dosya kayıt konumunu girin. Ve görüntü alımı başlatmak için LSM Start'a tıklayın.

Ve dosyaları kendi mikroskop formatında kaydet. Edinimden sonra, farklı boyaların sinyal ve odak dağılımını tüm Z yığınında doğrulamak için Z navigasyon oklarını kullanın. Kaydedilen oir dosyasını Bio-Formatlar İç Aktarma Seçenekleri açılır penceresinden Image J.In yükleyin, Tamam'a tıklayın.

Dosyayı açmak için Görsel Menüsü'ne tıklayın. Ve açılır menüden Color'u seçin, ardından Kanalları Böl seçeneğini seçerek farklı kanalları ayrı pencereler olarak açın. Sonra, görüntünün görselleştirilmesini artırmak için Image menüsünün altındaki Adjust seçeneğiyle parlaklık kontrastını ayarlayın ve LUT değerlerini optimize edin.

Çerçevenin altındaki Z ekseni kaydırma çubuğunu kullanarak optik bölümleri dolaşın ve yığın genelindeki hücresel özellikleri doğrulayın. Görsel menüsünde Stack'i seçin. Sonra, üç boyutlu konfokal görüntünün toplam yoğunluk projeksiyonlarını oluşturmak için Z Projesi fonksiyonunu seçin.

Z Projeksiyonu diyalog kutusunda, başlangıç ve bitiş dilim aralıklarını belirleyin. Projeksiyon türünü seçin ve Tamam'a tıklayarak son 2D bileşik görüntüyü elde edin. Sonra, Görsel menüsüne gidin.

Görüntü tipini 16-bit olarak ayarlamak için Tip seçeneğini seçin. Sonra, görüntüleri 16-bit TIF dosyaları olarak kaydedip dışa aktarın. Kaydedilen görüntüleri otomatik hücre segmentasyonu, her hücre için yansıtılan ışık yoğunluğunun nicelendirilmesi ve yoğunluk ölçüm değerlerinin bir tabloya aktarılması için CellProfiler sürüm 4.2.8'e aktarın.

Elektronik tabloda, yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz pozitifliği eşiğini, pH 8 koşulunun ortalama yansıtılan ışık yoğunluğu artı üç standart sapmanın toplamı olarak tanımlayın. pH 6 koşulundaki hücreleri, yoğunluk değerleri belirlenen eşiği aşıyorsa yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz pozitif olarak sınıflandırın. İnsan SVF hücrelerinin ışıkla yaşlanmasıyla ilişkili beta-galaktosidaz boyaması, üç pH seviyesinde net ve tekrarlanabilir desenler üretti.

pH 5'te, çoğu hücre yüksek endojen enzim aktivitesi nedeniyle güçlü bir sinyal gösterdi. pH 6 standart değerinde, sinyal yoğunluğu ve frekansı azaldı, bu da yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz hücrelerinin spesifik tanımlanmasına olanak sağladı. pH 8'de sinyal minimaldi ve bu, pozitiflik eşiğini belirlemek için bir temel oluşturdu.

Algılama hassasiyet testi, yansıtılan ışık görüntülemenin tüm pH koşullarında Brightfield'dan daha iyi performans gösterdiğini gösterdi. pH 5'te yansıyan ışık güçlü X-Gal çökelmeleri gösterirken, Brightfield sadece en büyük yatakları yakaladı. pH 6'da, yansıtılan ışık, Brightfield'da göremeyecek kadar zayıf veya dağınık pozitif hücreleri tespit etti.

pH 8'de, yansıtılan ışık görüntülemesi düşük enzimatik aktiviteyle uyumlu minimal sinyal tespit etti ve orta ve alt aktivite seviyelerinde X-Gal çökeltmelerini tespit etmede Brightfield'ı geride bıraktı. Genel olarak, bu yansıtılmış ışık görüntüleme iş akışı, pH bağımlı yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz ve CD31 gibi floresan tabanlı belirteçlerin eşzamanlı tespitini entegre ederek, heterojen SVF popülasyonlarında tek hücre çözünürlüğünde çok özellikli yaşlanma değerlendirmelerini kolaylaştırır. Bu protokol, hassas ve nicel SABG aktivite ölçümlerini sağlarken, aynı zamanda hem diğer yaşlanma belirteçlerini hem de diğer hücresel belirteçleri de kabul eder.

Bence en büyük zorluk ilk mikroskopi kurulumu. Ama bu optimize edildikten sonra, aynı satın alma parametrelerini deneyler boyunca kullanabilirsiniz. Gelecekteki çalışmalar, bu testi diğer subhücre belirteçleriyle birleştirerek SABG'nin farklı hücresel süreçlerle nasıl ilişkili olduğunu görebilir.