Xenopus erken embriyogenezinde yeni başlayan transkriptomun metabolik etiketlenmesi

Bu çalışmada, erken ksenopus embriyosu doğuşunda zigotik gen aktivasyonunun ve geçiş düzenlemesinin nasıl gerçekleştiğini inceliyoruz. Mevcut yöntemler, yeni aktive edilen zigotik transkriptlerin bol miktarda anne RNA'ları yaymasını tespit etmekte zorlanmaktadır. Bu protokol, yeni başlayan transkriptleri etiketler ve zenginleştirir.

Başlamak için, mikroenjeksiyon odasını stereo mikroskop altına yerleştirin ve odaya bir mililitre Ficoll çözeltisi ekleyin. 0.1X işaretli modifikasyonlu ringerlerde veya MMR çözeltisinde depolanan Xenopus laevis embriyolarını elde edin. Mikroenjeksiyon odasının merkezine 20 veya daha fazla embriyoyu transfer etmek için plastik transfer pipeti kullanın.

Enjeksiyon iğnesini cam iğnenin ince ucunu cımbızla keserek hazırlayın. İğneyi ucu aşağıya bakacak şekilde dikey konumlandırın ve mikro yükleyici ucu olan P2 pipeti ile 50 mM 5-etiniluridin veya 5 M EU 0,5 mikrolitre yükleyin. İğneyi mikro manipülatöre takın.

P10 pipeti kullanarak, 10 mikrolitre halokarbon yağı, stereo mikroskop altında yerleştirilmiş bir aşama mikrometresine yerleştirin. Hacim kalibrasyonu için mikro enjektör ayak pedalına basın ve mikrometredeki halokarbon yağına bir damla enjekte edin. Mikro enjektördeki basınç ve enjeksiyon süresini damla çapı 0,27 milimetreye kadar ayarlayın.

Bir hücre aşaması embriyosunu cımbızla tutun ve iğneyi mikro manipülatör ile kontrol ederek 10 nanolitre 50 mM 5 EU enjekte edin. Enjekte edilen embriyoları, Ficoll çözeltisi içeren yeni bir cam kaba aktarın ve bir saat kuluçka yapın. Ficoll çözümünü kaldırın ve 0.1 XMMR çözümü ekleyin. Gelişim sırasında embriyoları görsel olarak inceleyin ve gerekirse anormal embriyoları çıkarın.

İstenen gelişim aşamasında 10 embriyoyu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpten kalan ortamı çıkarın, embriyoları sıvı azotta hızlı dondurun ve -80 derece sıcaklıkta dondurucuda saklayın. Sonra embriyolardan toplam RNA çıkarılır ve ticari kitlerle konsantrasyonunu ölçür.

50 mikrolitrelik bir tık reaksiyonu yapmak için, gösterilen bileşenleri 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde karıştırın. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında bir nutator üzerinde 30 dakika kuluçka edin. Şimdi her reaksiyon karışımına glikojen, amonyum asetat ve soğutulmuş etanol ekleyin.

Beş kez pipetle iyice karıştırın. Gece boyunca -80 derece soğutulmuş dondurucuda kuluçka edin. Gece kuluçkasından sonra, 13.000 G'de 20 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın, ardından süpernatantı pelleti rahatsız etmeden çıkarın.

Pelleti 700 mikrolitre %75 etanol ile iki kez yıkayın. Süpernatantı santrifüj edip attıktan sonra, pelleti oda sıcaklığında beş ila 10 dakika hava kurutma işlemi yapılacak ve pelleti 10 mikrolitre RNase içermeyen suya yeniden süsleyin. Beş mikrolitre streptavidin kaplı manyetik boncukları yeni 1,5 mililitrelik bir tüpe dağıtın.

Boncuklara dokuz mikrolitre yıkama tamponu 2 ekleyin ve iyi karıştırın. Tüpü manyetik bir rafın üzerine iki dakika koyun. Üst maddeyi çıkarın ve yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Sonra boncukları beş mikrolitre yıkama tamponu 2'de tekrar askıya alın. 1.5 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüpünde master karışım hazırlayın. RNA örneğini içeren her tüpe 15 mikrolitre ana karışım ekleyin.

Tüpü bir ısı bloğuna yerleştirin ve 69 derece Celsius'ta beş dakika kuluçka yapın. Sonrasında tüpü buz üzerine koyun. Sonra her RNA örneğine beş mikrolitre önceden yıkanmış boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında bir nutatorda 30 dakika kuluçka yapın.

Boncuk RNA komplekslerini 50 mikrolitre yıkama tamponu 1 ile beş kez yıkayın, ardından 50 mikrolitrelik yıkama tamponu 2 ile beş yıkama yapın. Boncukları beş mikrolitre yıkama tamponu 2'de tekrar askıya alın. Yeni kurulan EU RNA'larını içeren boncukları doğrudan tamamlayıcı deoksiribonükleik asit sentezi ve kütüphane hazırlığı için kullanın.

Züt genom aktivasyonu sırasında, döllenmeden altı saat sonrakı yeni transkriptom ile döllenmeden beş saat sonrakiyle karşılaştırıldığında, döllenmeden yedi saat, döllenmeden sekiz saat ve dokuz saat sonra daha fazla artış gözlemlendi. Zigotik genler, yeni başlayan EU RNA dizileme verilerinde toplam RNA dizileme verilerine kıyasla daha yüksek seviyelerde ve daha erken zamanlarda tespit edilmiştir. Metabolik olarak etiketlenmiş yeni başlayan RNA'ların dikkatli arındırılması, bu protokolde hassasiyet ve özgüllüğü sağlamak için en kritik faktördür.

Bu protokolle üretilen AB etiketli yeni başlayan RNA'lar, in vitro biyokimyasal olarak daha fazla analiz edilebilir. Bu yaklaşım, gelecekteki çalışmaların genom aktivasyon kalıplarını, dokuya özgü gen ifadesini ve düzenleyici mekanizmaları tek hücre çözünürlüğü olarak incelemesini mümkün kılar.