Tert-bütil hidroperoksit kullanarak birincil insan melanositlerinde stres kaynaklı erken yaşlanma için standart bir protokol

Araştırmamız, melanositlerin senesans fenotipini ve bunun ekstrinsik cilt yaşlanmasına olan katkısını incelemeye odaklanmaktadır. Mevcut senesans modelleri fibroblastları kullanmakta ve melanosite özgü biyolojiyi yakalamada yetersiz kalmaktadır. Bu protokol, primer insan melanositlerinde tBHP aracılı oksidatif stres indüklemektedir.

Başlamak için gerekli reaktifleri hazırlayın. Melanositleri çözüp üç gün boyunca toparlanmalarına izin verdikten sonra, ekim gününde hücrelerin %80 ila %90 konfluens düzeyine ulaştığından emin olun. Flasktaki besiyerini aspire edin.

Hücreleri iki kez DPBS ile yıkayın. Hücreleri ayırmak için iki mililitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Balonu %5 karbon dioksit içeren 37 °C sıcaklıktaki inkübatöre beş dakika boyunca yerleştirin.

Erleni hafifçe tıklatın. Ardından, hücrelerin tamamen ayrıldığını doğrulamak için mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Reaksiyonu durdurmak için hacmin 1,5 katı kadar tripsin inhibitörü ekleyin.

Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Süspansiyonu DPBS ile 10 mililitrelik bir son hacme gelecek şekilde seyreltin. Hücre süspansiyonunu 100 bağıl santrifüj kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini istenen hacme ulaşacak şekilde besiyerinde yeniden süspande edin. tert-Bütil hidroperoksit veya tBHP uygulanacak plaklar için 10 santimetrelik kap başına 600.000 hücre ekleyin. Kontrol plakları için plaka başına 400.000 hücre ekleyin.

tBHP stokundan DPBS veya besiyeri kullanarak 10 millimolar çalışma çözeltisi hazırlayın. Her işlem için hücrelere bir saat boyunca 100 micromolar tBHP ekleyin. tBHP'nin besiyeri genelinde eşit şekilde dağılması için plakayı ileri geri hareket ettirin.

Hücreleri 37 °C'de ve %5 karbondioksit içeren inkübatörde tam bir saat boyunca bekletin. tBHP işlemini sonlandırmak için medyumu aspire edin. Plakaları 37 °C'de önceden ısıtılmış DPBS ile iki kez yıkayın.

Plakalara uygun hacimde taze besiyeri ekleyin. Plakaları inkübatöre yerleştirin ve bir sonraki işlemden önce hücrelerin en az dört saat boyunca toparlanmasını sağlayın. İkinci işlem için aynı günün ilerleyen saatlerinde işlem prosedürünü tekrarlayın.

Tedavi rejimine dördüncü güne kadar devam edin, ardından senesans belirteçlerini değerlendirmek için hücreleri dokuzuncu güne kadar kültürde tutun. tBHP ile işlem görmüş hücreleri ve kontrol hücrelerini sayın. Hücreleri aynı başlangıç yoğunluğunda yeniden ekimleyin veya tBHP ile işlem görmüş plakalardan 600,000 hücreden daha az elde edildiyse toplanan tüm hücreleri yeniden ekimleyin.

Kültürün dördüncü, dokuzuncu ve 15. günlerinde hücreleri sayın. Dokuzuncu günde, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Hücreleri %2 formaldehit ve %0,4 glutaraldehit kullanarak fikse edin.

Fikse edilmiş hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Fikse edilmiş hücreleri pH 6 değerindeki bir boyama çözeltisi içinde inkübe edin. Plakayı ışıktan korumak için kapatın, ardından hücreleri karbondioksit yokluğunda 37 °C'de 18 saat boyunca inkübe edin.

Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Işık mikroskobu kullanarak, mavi boyanmış hücreleri görüntüleyin ve sayılarını belirleyin. Bu sayıyı aynı görüş alanındaki toplam hücre sayısına bölün.

Sonuçları pozitif hücrelerin yüzdesi olarak ifade edin. Oksidatif stres indüksiyonunun ardından, tBHP uygulaması melanosit proliferasyonunu kontrollere kıyasla önemli ölçüde azaltmıştır. Uygulama yapılan hücreler dokuzuncu güne kadar yalnızca 1.4 kümülatif popülasyon ikiye katlanmasına (cPDL) ulaşırken, kontroller 3.1 cPDL'ye ulaşmıştır.

15. güne gelindiğinde, işlem görmüş hücreler 1,9 cPDL değerinde durağanlaşırken, kontrol hücreleri 5,1 cPDL'ye kadar genişlemiştir. tBHP ile işlem görmüş melanositler, ölçülen tüm zaman noktalarında kontrollere kıyasla artmış hücre yüzey alanı göstermiş ve bu büyüme 15. güne kadar ilerleyerek senesent hücrelerin genişlemiş ve yassılaşmış morfolojisiyle uyumlu bir seyir izlemiştir. tBHP ile işlem görmüş melanositler, kontrollerdeki %3'lük orana kıyasla %32 pozitif hücre ile senesensle ilişkili beta-galaktosidaz veya SA-beta-galaktosidaz aktivitesinde bir artış göstermiştir.

SA-beta-galaktosidaz pozitifliğindeki artış, senesent bir fenotiple tutarlıydı. İmmünofloresan analiz, tBHP ile işlem görmüş melanositlerde kontrollere kıyasla artmış gamma-H2AX seviyeleri gösterdi. İşlem görmüş hücreler, kontrollere göre daha güçlü gamma-H2AX sinyali sergiledi.

Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu analizi, interlökin-8'in en büyük artışı göstermesiyle birlikte, yaşlanma ile ilişkili salgılayıcı fenotip faktör ekspresyonunda artış olduğunu göstermiştir. İnterlökin-6 ve matriks metalloproteinaz-1 ise orta düzeyde artışlar göstermiştir. Western blot analizi, yaşlanma indüksiyonunu doğrulamıştır.

tBHP ile işlem görmüş melanositlerde, kontrollere kıyasla Lamin B1 seviyelerinde belirgin bir azalma gözlenmiştir. tBHP ile işlem görmüş melanositlerde, fosforile retinoblastom proteini seviyeleri kontrollere göre azalmıştır. tBHP uygulaması, melanositlerde p16 ve p21'in transkripsiyonel ekspresyonunu artırmıştır.

Bu model, araştırmacıların senesent melanositlerin pigmentasyonu nasıl etkilediğini ve SASP inflamatuar faktörleri aracılığıyla çevre hücrelerle nasıl iletişim kurduğunu incelemelerine olanak tanır. Bu protokoldeki zorluk, zamanlamanın hassasiyetidir. tBHP, günde iki kez ve en az dört saatlik aralıklarla uygulanmalıdır.

Bu protokol takip edilerek, yaşlılık; yaşlılıkla ilişkili beta-galaktosidaz boyaması, immünofloresan, RT-qPCR ve belirlenmiş yaşlılık belirteçlerinin Western blotting yöntemleri kullanılarak karakterize edilebilir.